V, ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR SCEAUX. I M I' rt 1 M K R 1 K CHAllAlP. E ET FILS. I i B ANNALES ''iSrf^r (Ê^lsasd..; DE L'INSTITUT PASTEUR (JOURNAL DE MICROBIOLOGIE) PUBLIÉES SOUS LE PATRONAGE DE M. PASTEUR PAR M. E. DUGLAUX MEMBRE DE l'iNSTITUT PROFESSEUR A LA SORBONNE Et un Comité de rédaction composé de MM. CHAMBERLAND, chef de service à l'Institut Pasteur, Dr GRANCHER, professeur à la Faculté de médecine, METCHNIKOFF, chef de service à l'Institut Pasteur. NOCARD, directeur de l'École vétérinaire d'Alfort, Dr ROUX, chef de service à l'Institut Pasteur, Dr STRAUS, professeur à la Faculté de médecine. CINQUIEME ANNÉE 1891 Avec dix-neuf planches PARIS G. MASSON, ÉDITEUR LIBRAIRE DE L'ACADÉMIE DE MÉDEGITfE 120, BOULEVARD SAINT-GERMAIN Cn face de l'école de médecine 1891 5-"^ ANNÉE. JANVIER 1891. N» 1 >^rr 1 f > » ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR CONTRIBUTION A L'ÉTDDE DU TÉTANOS Par mm. L. VATLLARD, et H. VINCENT, médecin major de l^e classe, professeur médecin aide-major de agrégé du Vai-de-Gràce. if^ classe. (travail du laboratoire de bactériologie du val-de-grace.) Le tétanos est produit par le développement constant, au niveau de la plaie provocatrice, d'un bacille spécial que Nico- laier a rencontré et décrit en 1884 dans le pus des animaux rendus tétaniques par l'inoculation de parcelles de terre. La spécificité du microbe de Nicolaier a été mise hors de doute par M. Kitasalo', qui, après avoir isolé cet organisme du pus d'un homme tétanique ou d'animaux infectés avec de la terre, l'a cultivé le premier à l'état de pureté, et a montré que l'inocula- tion de ces cultures pures à diverses espèces animales provoquait sûrement tous les symptômes du tétanos spontané. Dans son important mémoire, M. Kitasato a fourni un procédé d'isolement facile du bacille tétanique, et définitivement fixé ses caractères morpholog-iques et quelques-unes de ses propriétés biologiques principales. Si ce travail n'a pas résolu toutes les questions que soulèvent l'étiologie et la pathogénie du tétanos, du moins il a 1. Kitasato, Le bacille du tétanos. Zeitsch. f. Hyg., novembre 1889. 1 2 ANNALES DE LI'NSTITUT PASTEUR. bien préparé le terrain pour l'étude expérimentale de lamaladie; aussi est-il devenu le point de départ de recherches déjà riches en données intéressantes, et aussi de celles que nous publions aujourd'hui. I LE BACn>LE DU TÉTANOS : SES CARACTÈRES; SA CULTURE. SPORE. INicolaier a décrit l'agent pathogène du tétanos sous la forme d'un bacille long-, grêle, dont une extrémité présente d'abord un renflement colorable et plus tard une spore brillante, aspect qui le fait ressembler à une épingle. M. Kitasato a complété cette description en montrant que cette manière dètre du bacille n'é- tait cependant pas la seule, et que dans le pus des tétaniques, il pouvait aussi se présenter, avant la phase de sporulation, comme un bâtonnet mince, allongé, linéaire; cette particularité a expliqué pourquoi certains auteurs (Widenmann, Flugge) avaient cru que le bacille spécifique ne se trouvait pas d'une manière con- stante dans le pus de Ihomme ou des animaux tétaniques. Ce bacille ne se rencontre, en règle générale, qu'au niveau de la plaie, dans le pus, la couche superficielle de la poche purulente ou à son voisinage immédiat; il y est toujours mélangé à des organismes divers. Pour l'extraire à l'état de pureté, on peut recourir au procédé décrit par M. Kitasato, basé d'une part sur la résistance particulière de la spore du bacille tétanique à l'action de la chaleur, et d'autre part sur la qualité anaérobie du microbe. Le moyen que nous avons employé i\''en diffère pas essentiellement. Le pus ou le produit recelant le bacille du tétanos est ense- mencé dans du bouillon de bœuf et cuUivé dans le vide à la tem- pérature de 38-39°. Rapidement le bouillon se trouble; après cinq ou six jours, il contient de nombreux bacilles en épingle au milieu d'autres microbes anaérobies, souvent aussi sporulés. Une très petite quantité de cette culture impure est soumise pendant une ou deux minutes, et en vase clos, à la température de lOÛ" au bain-marie; ce chauffage, insuffisant pour détruire les spores du tétanos, tue la plupart des germes étrangers qui lui sont associés. Mise en bouillon et dans le vide, cette semence donne une culture où le bacille du tétanos est de beaucoup prédomi- GONTRIIÎUTION A L'ÉTUDE DU TÉT.VNOS. 3 liant, parfois même pur. En répétant deux ou trois fois le chaulTage et la culture dans les mêmes conditions, il est pos- sible, sans autre moyen, d'obtenir le bacille du tétanos à l'état de pureté. Souvent cependant il reste mélangé au vibrion septique et à un bacille qui n'est pas sans offrir quelque analogie de forme avec celui de Nicolaier '. Pour le séparer, il convient alors de recourir aux milieux solides, à la gélatine, en suivant l'un ou l'autre des procédés décrits par M. Roux pour l'isolement des anaérobies, ou encore celui qui a été recommandé par M. Vignal dans le même but; ce dernier, commode et simple, nous a servi le plus souvent -. Les colonies du bacille tétanique apparaissent du 4*^ au 6*^ jour, suivant la température à laquelle se fait la culture. Ce sont, au début, de petites sphères nuageuses dont le centre est occupé par un point blanchâtre; la partie périphérique est for- mée de fins rayons, régulièrement disposés en auréole. Les jours suivants, l'auréole s'agrandit en divergeant, et l'ensemble de ses prolongements enchevêtrés donne une image qui rappelle le mycélium des moisissures ; des bulles de gaz disloquent la gélatine au voisinage des colonies et, du 10^ au lo^ jour, la liquéfaction commence. Les bacilles prélevés dans les colonies naissantes n'offrent pas l'aspect caractéristique en épingle; ils se présentent comme des bâtonnets réguliers ou des filaments semblables à ceux du vibrion septique. A la température où la culture a été faite, la sporulation ne se produit, en effet, que tar- divement, et le renffement qui la précède n'est pas encore formé au moment oii les colonies sont utilisées. Le bacille du tétanos est anaérobie; il se cultive dans le vide ou dans une atmosphère d'hydrogène. Si les milieux rigoureu- sement privés d'oxygène libre sont les plus appropriés à son développement, celui-ci n'exige cependant pas l'élimination com- plète de toute trace de ce gaz. On peut cultiver le microbe dans un vide relatif et l'habituer à croître dans un air à peine raréfié, 1. Ce bacille pseudo-tétanique présente, à un stade de son évolution, un ren- flement terminal bientôt occupé par une spore plutôt ovoïde qu'arrondia et qui n'est pas exactement terminale comme dans le cas du bacille de Nicoluier; le corps du bâtonnet est aussi plus épais, et sa mobilité est très marquée. La grande résistance de ses germes à la chaleur n;; permet pas de l'éliminer par le seul chauffage. Cet organisme n'est point pathogène pour les animaux. 2. Vignal, Ann. Inst. Past., 1887, p. 3o8. 4 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. sans que son aclivilé pathogène pai'aisse grandement modifiée. Jl se développe en vase ouvert dans des milieux disposés en couche épaisse, pourvu que l'accès de l'air soit assez limité. Ainsi on obtient des cultures abondantes et rapides sur les milieux, bouillon, gélatine, gélose, non purgés d'air, dans un tube étroit bien rempli et hermétiquement clos, ou bien dans une pipette ordinaire simplement étranglée au-dessus du niveau du liquide, et sans qu'il soit nécessaire d'obturer l'extrémité ouverte. Les cultures ainsi obtenues sont très actives. Toutefois, les cultures strictement anaérobies correspondent le mieux aux pro- priétés biologiques du microbe; ce sont celles que nous avons exclusivement utilisées. Les milieux liquides, bouillons de bœuf, de veau, de poule, conviennent particulièrement à la culture du bacille du tétanos; ils se prêtent surtout bien à l'étude des produits élaborés par lui. Nos cultures les plus actives ont été obtenues dans le bouil- lon de bœuf ou de poule préparé avec une partie de viande pour deux parties d'eau. Dans le bouillon, le bacille se développe rapidement à la température de 39". Après 24 heures, le liquide est trouble et dégage par l'agitation de fines bulles de gaz; le trouble aug- mente par la suite, mais, vers le IS^jour, la culture se ralentit ou cesse, et il se forme un dépôt au fond du vase. Cette culture exhale une odeur pénétrante, très spéciale et qui se révèle à dis- tance. Pendant son développement, le microbe a dégagé de l'acide carbonique et des traces de gaz hydrocarboné. La réaction du milieu est très alcaline. Déjà, après 36 heures, on rencontre, à côté de bâtonnets réguliers, courts ou longs, de nombreux bacilles sporulés. Vers le 10" jour, on ne trouve g-uère plus que des bacilles avec spores: ce sont alors des bâtonnets grêles, en général courts, portant à une extrémité une petite sphère arrondie, de diamètre deux ou quatre fois plus large que le corps môme du bacille, exacte- ment terminale, d'un éclat brillant; c'est bien la forme d'une épingle. Les conditions de température, compatibles avec la végéta- tion du microbe, oscillent entre 14° et 43°. Au-dessous de 14° la végétation ne se fait pas. De 18 à 20'^, le développement est très lent et ne commence à devenir appréciable CONTRIBUTION A L'ETUDK DU TETANOS. 5 qu'au bout d'une semaine. De 20 à 2.')°, la culture est déjà mani- feste le Séjour, mais la formation des spores est tardive. Dans les premiers jours, la culture est uniquement constituée par des bâtonnets réguliers, en général assez longs, parfois filamenteux et légèrement mobiles : on dirait du vibrion septique. Au lû^jour, les bacilles sporulés sont extrêmement rares; après 20, 30 jours, les bâtonnets sont encore presque aussi nombreux que les bacilles à spore terminale. Les cultures faites à cette température sont presque inactives dans les cinq ou six premiers jours de leur développement; on peut en inoculer impunément des doses élevées ( '/i, V^ centimètrecube) àun animal très sensiblecommele cobaye. Mais du 10^ au 12'' jour, leur activité devient grande; il sufdtalorsde'/js de centimètre cube, etmoinsencore,pourdonner au même animal un tétanos intense, mortel en trois jours. A la température de 38-39'\ la végétation du microbe et la formation des spores sont très rapides ; alors aussi, presque dès les premières heures, la culture est très active. Un quinzième de centimètre cube d'une culture de 18 heures tue le cobaye en 30 ou 60 heures. Après deux jours, la même dose entraîne la mort en 30 heures; au 4^ jour, elle fait périr en 20 heures. Ultérieure- ment, l'activité des cultures augmente pour atteindre son maxi- mun du 10e au lo^ jour. Le bacille du tétanos croît, même très rapidement, à la tem- pérature de 42 ou 43°. Mais alors la plupart des bacilles ne produisent plus de spores; ils apparaissent comme des bâtonnets granuleux et peu colorables, des filaments démesurément longs ou des bacilles présentant des formes renflées, arrondies, en poires, en fuseau, etc. Il ne s'est produit cependant aucune atté- nuation appréciable. Les liquides organiques, comme l'albumine de l'œuf, l'hu- meur aqueuse, le sérum frais et liquide du sang' de bœuf, de lapin, de cobaye, semblent peu favorables à la végétation du microbe. Lorsqu'on y transporte une semence prise en bouillon, la plupart des bacilles qui se développent ne sporulent pas et présentent des formes d'involution ; la culture est peu abondante, parfois à peine appréciable, et ne dégage aucune odeur; elle n'en est pas moins très active. La croissance du microbe est, au contraire, normale sur le sérum coagulé. 6 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. Les cultures faites dans le sang frais du lapin possèdent un grand pouvoir pathogène ; elles donnent un tétanos mortel au lapin àladoseminima de V»» Vi . decentimètrecube, alors que pour arriver à ce résultat avec la même semence entretenue en bouil- . Ion, il est nécessaire d'inoculer un demi ou un centimètre cube. Les cultures en gélatine se font aisément sans recourir au vide ou au barbottage d'un courant d'hydrogène; les procédés simples décrits par M. Roux suffisent, et l'on obtiendra de beaux développements en ensemençant, dans un tube ordinaire, de la gélatine privée d'air par l'ébullition et disposée en couche de 10 à 12 centimètres d'épaisseur. Les caractères de la culture ontété biendécritsparMM. Kitasato, SanchezToledo et Veillon'. Celle-ci est formée par un nuage qui envahit toute la partie inférieure du cylindre de gélatine ; la liquéfaction survient en général vers le 10^ jour, et il se forme progressivement au fond du tube un dépôt floconneux de microbes, surmonté par une couche de gélatine claire et fluide. A son début, pendant sa période nua- geuse, la culture n'exhale aucune odeur; elle est uniquement formée de bâtonnets, de filaments mobiles, et son activité est alors très peu marquée : on peut en inoculer une dose appré- ciable à un animal sensible sans provoquer aucun phénomène tétanique. Mais, lorsque la liquéfaction a commencé, les spores se forment, l'odeur caractéristique apparaît, et l'activité de la culture est grande. Y'V Le bacille du tétanos se développe sur la gélose sans carac- • 1ère spécial. Il croît difficilement sur la pomme de terre. Nous avons réussi une seule fois à l'obtenir surce milieu où il formait une couche hum'de, luisante, assez semblable à celle que donne le bacille typhique, composée de très longs bâtonnets sans ren- flement ni spore. Le bacille est doué d'une légère mobilité lorsqu'il est à l'état de bâtonnet ou do filament; tout mouvement disparaît lorsque se produit le renflement terminal, précurseur de la spore. Les cultures en bouillon et sur milieux solides conservent pendant très longtemps leur vitalité soit à l'étuve, soit à la tem- pérature ordinaire, lorsqu'elles sont maintenues à l'abri de l'air; 4. Sancliez Toledo et Veillon, Rech. microbiol. et expérini. sur le tétanos. Arch. de Méd. expérim., nov. 1890. COiNTIUBUTION A L'ETUDE DU TETANOS. 7 rajeunies, après pliisde six mois, elles donnentuii développement abondant et se montrent très actives. Spore du hacille UHauique. — Les spores du bacille tétanique comptent parmi les plus résistantes à Faction de la chaleur. Chautîees en vase clos et en milieu humide, au bain-marie, elles supportent pendant six heures la température de 80°, et ne sont pas tuées par un séjour de une heure et même de deux heures à 90". Elles résistent, sans rien perdre de leurs aptitudes, à Ja température de l'ébuUition pendant 3 ou 4 minutes, mais sont détruites (non toujours cependant) après 5 minutes; jamais nous n'avons trouvé de spores vivantes lorsque la chaulfe avait été prolongée au delà de 8 minutes. Selon iM. Kitasato, les spores desséchées conservent pendant des mois leur vitalité et leur virulence à l'air libre, dans de la terre abritée contre la lumière ; il en serait de même, d'après MM. Sanchez Toledo et Veillon, lorsqu'elles sontexposées à la lumière diiïuse. Il résulte, au contraire, de nos recherches, que les spores desséchées sont très sensibles à l'action de la lumière dilTuse ou de la radiation solaire, lorsque celles-ci s'exercent en présence de l'air; elles subissent, en effet, des modifications plus ou moins profondes qui, pour se produire, n'exigent pas un temps très long : leur germination devient d'abord moins rapide et leur culture moins active, puis elles donnent naissance à des bacilles dénués de tout pouvoir patho- gène, incapables de produire des spores et d'en former ultérieu- rement dans les cultures successives; enfin elles périssent après un délai qui n'a guère excédé un mois. En juillet dernier, des spores provenant d'une culture en bouillon et desséchées sur du papier ont été exposées, en vase ouvert, à la lumière diffuse et au soleil quand il paraissait; pendant la durée de l'expérience, la température intérieure des vases ne dépassa pas SS''. Après 6 jours, ces spores ont donné une culture maigre, formée de bacilles sans renflement, défmi- vement asporogènes et dénués d'activité. Après \2 jours, toutes les spores avaient péri. Deux séries d'expériences ont donné des résultats identiques. Une 3" expérience est faite en octobre avec des spores pré- levées dans une cultureen gélatine. Après 10 jours d'exposition à la lumière ditfuse, au contact de l'air, et 46 heures d'insola- 8 . ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. lion ( T'" maxima à l'intérieur des vases = 28"), ces spores ont donné des cuUures très actives, formées de bacilles sporulés. Après 32 jours, sur lesquels on compta 60 heures d'in- solation, la plupart des spores avaient péri; quelques-unes se développaient en donnant des bacilles granuleux, déformés, res- semblant souvent à des chaînettes de eoccus, asporogènes et sans activité. A l'abri de la lumière, l'action de l'air, pour être un peu plus lente, n'en est pas moins certaine. Des spores provenant d'une culture en bouillon sont desséchées sur du papier, puis incluses dans un flacon noirci que l'on fait traverser par un léger courant d'air. Déjà après 17 jours de cette aération, on obtint, par l'en- semencement du papier, des cultures inactives formées de bacilles asporogènes. Toutes les spores n'étaient pas également atteintes, car après 22 jours (l'expérience n'a pas été suivie au delà), une des cultures faites donnait quelques rares bacilles sporulés. Ces résultats concordent d'ailleurs avec les faits assez nom- breux 011 l'on a vu des terres ou des poussières tétanigènes perdre assez rapidement leur pouvoir infectieux, au contact de l'air et de la lumière diffuse. Il est intéressant de constater que, dans ces conditions, les spores donnent naissance à des bacilles bien différents des bacilles originels, et désormais incapables de produire des germes. Tout autrement se comportent les spores, lorsque la lumière agit à l'abri de l'air. Après plus de deux mois sur lesquels on compte 59 heures d'insolation, les spores germent, il est vrai avec un retard, mais donnent des bacilles bien sporulés et très actifs. Quelquefois cependant, nous avons eu des cultures sur- tout formées de bacilles asporogènes, ■ On peut imaginer que, dans le sol, les spores du tétanos pourront trouver aisément des conditions très propices à une longue conservation ; il n'en saurait être de même pour celles qui résident à la superficie. Nous avons extrait des terres de sur face, par la culture, des bacilles absolument identiques au bacille du tétanos parleurs caractères morphologiques, faisant comme lui des spores rondes et terminales, mais dépourvues de pouvoir pathogène. S'agissait-il du bacille du tétanos modifié parles agents cosmiques? Cela nous a paru vraisemblable. Nous CONTRIBUTION A L'ÉTUDE DU TFXVNOS. 9 avons essayé de lui faire récupérer l'activité perdue sans y réus- sir jusqu'ici '. II INOCULATION DES CUI.TUUES AUX ANIMAUX; RECHERCHE DU BACILLE TÉTANIQUE SUR LE CADAVRE. L'inoculation des cultures pures du bacille tétanique déter- mine sûrement chez les animaux réceptifs tous les symptômes caractéristiques du tétanos spontané. La souris blanche, le rat et le cobaye sont les animaux les plus sensibles à Faction du virus ; le lapin l'est à un degré moin- dre. Le chien est très résistant. Le pigeon et surtout la poule peuvent supporter sans dommage des quantités très considé- rables des cultures les plus actives. Une dose extrêmement faible de culture en bouillon ('Aoo de centimètrecubeetmêmemoins)sufritpourdonnerà la souriset au cobaye un tétanos typique qui débute après une période d'incuba- tion de 12 à 20 heures, et détermine la mort dans les 36 ou 40 heures qui suivent l'inoculation. Le lapin exige des doses plus fortes, variant, selon les sujets ou l'activité des cultures, de O'^SS à l'',5. Chez cet animal, la période d'incubation et la durée de la maladie sont toujours plus longues : les premiers symp- tômes n'apparaissent guère que du 2« au 3« jour, quelquefois même plus tard, du 6« au 8° jour; l'évolution des accidents est aussi moins rapide, et la mort ne survient que 3, 4 et même 10 jours après le début du tétanos. L'injection sous la peau, dans les muscles, le péritoine, les veines ou sous la dure-mère, réussit également bien; l'inocula- tion reste sans effet lorsqu'elle est faite par la voie digestive.On peut encore donner le tétanos au cobaye en laissant tomber deux ou trois gouttes de culture sur une plaie cutanée du dos, 1. L'agent pathogène du tétanos, si répandu à la surface du sol et des plantes, serait peut-être rapidement détruit par le? agents cosmiques, s'il ne trouvait dans son passage à travers le tube digestif des herbivores des conditions éminemment propices à son entretien et à sa multiplication, ainsi que l'ont établi MM. Sanchez Toledo et Veillon. . ' 10 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. très minime comme étendue, et intéressant à peine les couches les plus superficielles du derme. Mais de ces modes d'infection, aucun ne paraît ni plus sûr ni plus sévère que l'inoculation sous la peau ou dans les muscles; les effets ne sont pas plus prompts ou plus intenses lorsqu'on dépose la culture sous la dure-mère après trépanation, et la dose nécessaire pour donner ainsi le tétanos n'est pas inférieure à celle qu'il faut injecter par la voie sous-cutanée. Ainsi que tous les auteurs l'ont signalé, le tétanos expéri- mental commence toujours dans les régions du corps les plus immédiatement voisines du point inoculé, puis il s'étend aux membres correspondants, et en6n se généralise. Si l'inoculation est faite sous la peau de l'abdomen, le pleurosthotonos consti- tue le symptôme initial, auquel s'ajoute bientôt la rigidité du membre antérieur ou postérieur du même côté. Dans le cas d'une injection intra-musculaire, les muscles d'abord contractures sont ceux qui ont reçu le virus; mais si la dose employée est extrêmement faible, les sympômes tétaniques peuvent rester strictement limités au membre ou au groupe de muscles intéres- sés par l'inoculation. En déposant une goutte de culture sur la conjonctive du cobaye, on obtient parfois une contracture isolée et durable de l'orbiculaire des paupières. L'injection sous la dure-mère, après trépanation, provoque un tétanos qui, d'abord céphalique (trismus, opisthotonos, occlusion des paupières, sorte de rictus), devient ensuite rapide- ment général ; il est d'emblée général, lorsque l'inoculation est faite par la voie périlonéale ou sanguine. Suivant l'activité des cultures, la dose injectée ou la résis- tance des animaux, l'affection produite peut affecter la forme aiguë, rapidement mortelle, ou prendre des allures traînantes, chroniques et, après une durée de 10, 20, 30 jours même, aboutir soit à la guérison, soit à la mort'. Il existe généralement une i. MM. Tizzoni, Cattani et Baquis pensent que le t'Hanos aigu et le tétanos chronique pourraient être produits par deux microbes voisins, mais différents. Dans deux cas de tétanos aigu chez l'homme, ils ont rencontré le bacille de Nico- laier dont les cultures donnaient aux animaux un tétanos aigu, tandis que chez un troisième malade atteint de tétanos chronique, ils n'ont trouvé qu'un bacille à spore ovale, presque terminale, distinct du précédent par ses cultures, et produi- sant chez les animaux des contractures locales et la mort en 15 ou iO jours avec des symptômes de paralysie. D'où ils concluent : « Les deux formes cliniques, tétanos aigu ou chronique, quiTon observe chez 1 homme, peuvent être attribuées à CONTRIBUTION A L'ÉTUDE DU TÉTANOS. i[ relation entre la durée de rincubalion et la gravité des acci- dents qui vont suivre : plus la première est courte, plus aussi le tétanos est intense et rapidement mortel; lorsque, au con- traire, l'apparition des accidents est tardive, l'évolution de la maladie devient plus lente et n'entraîne la mort qu'après 6, 8 ou 10 jours. 11 n'est point rare, lorsque la période d'incubation dépasse 4 ou 5 jours chez le cobaye, et 8 jours chez le lapin, de voir les animaux prendre un tétanos chronique dont ils guérissent. A l'autopsie des animaux qui succombent après l'inocula- tion des cultures pures sous la peau, on ne trouve aucune lésion au point où l'injection a été faite, sauf parfois une minime hypérémie, ou, plus rarement, un œdème léger et circonscrit du tissu conjonctif. Si l'inoculation a été faite dans la cavité péri- lonéale, il peutse produire une exsudation de sérosité sanguino- lente. Les viscères ne présentent d'autre modification sensible qu'un état cong-estif lié à la gêne respiratoire qui précède la mort. 11 est extrêmement rare de trouver dans la région inoculée, par l'examen microscopique, les bacilles du tétanos ou leurs spores, même chez les animaux qui succombent dans un délai très court n'excédant pas 26 heures; lorsque la recherche est positive, c'est à peine si l'on en compte quelques unités sur un g-rand nombre de préparations. Mais, si on ensemence un lambeau de tissu conjonctif prélevé au même point, on obtient toujours une culture du microbe ; il en est également ainsi dans les cas où la mort survient 3, 4 ou 8 jours après l'inoculation. La recherche du bacille dans le sang ou les viscères par l'examen microscopique a toujours été négative; par le procédé des cultures, elle a fourni des résultats ditférents suivant le mode d'inoculation employé. Dans les cas où les animaux avaient suc- l'une ou l'autre de ces espèces ou à l'atténuation du bacille de Nicolaier. » La deuxième hypothèse est plausible; la première manque de l'ondement. La maladie provoquée chez les animaux par le bacille à spore ovale et presque ter- minale des auteurs italiens ne rappelle que de fort loin le tétanos typique, si tou- tefois elle lui ressemble. D'autre part, les faits expérimentaux démontrent qu'avec une culture pure du bacille tétanique, on peut déterminer chez le lapin ou le co- baye soit la forme aiguë, soit la forme chronique du tétanos. La distinction intro- duite par Tizzoni, Gatlaui et Baquis, en tant du moins qu'elle vise l'intervention de deux microbes différents dans la pathogénie du tétanos, est superflue et trè.s hypothétique. , 12 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. combé à une inoculalioii sous-cutanée, l'ensemencement de grandes quantités du sang, du foie, de la rate, des reins, du cer- veau, du bulbe, de la moelle épinière, recueillies à des périodes variables après la mort, est resté stérile; une seule fois cependant, en utilisant la presque totalité du cerveau d'un cobaye, nousavons obtenu une culture du bacille. Lorsque la mort succédait à l'ino- culation de grandes doses de culture dans les veines ou le péri- toine, il était ordinaire d'avoir des ensemencements féconds avec des quantités copieuses soit de la moelle osseuse, soit du foie, de la rate, ou du cerveau ; jamais le sang ne nous a paru contenir le microbe du tétanos. L'agent pathogène ne se dissémine donc pas dans l'organisme lorsqu'il a été déposé sous la peau, sous la dure-mère ou au milieu d'un muscle; il n'envahit ni le sang ni les organes, et c'est très exceptionnellement qu'il peut être rencontré dans un viscère. Sa présence dans les organes après inoculation intra-veineuse ne saurait surprendre. Les constatations précédentes établissent d'autre part que, loin de se multiplier au point d'inoculation, les microbes y diminuent de nombre dans des proportions telles qu'il est presque impossible de les retrouver après la mort par le seul secours du microscope ; cependant ils ne disparaissent pas d'une manière complète et absolue, puisque la culture per- met encore de les déceler. Nous avons cherché à savoir si, dans la période qui s'écoule entre l'inoculation et l'apparition du tétanos, il ne se faisait pas, à un moment quelconque, une pullulation fugace du microbe dans la région infectée. Chez des lapins inoculés sous la peau avec une grande quantité de culture, nous avons examiné le tissu conjonctif à des heures variables après l'injection : déjà au bout de 8 ou 6 heures, le nombre des bacilles est très minime; après 12 heures, ils sont représentés par quelques unités libres au milieu des éléments cellulaires; après 24 heures, leur présence est douteuse, mais la culture les décèle. L'examen méthodique de l'humeur aqueuse, après inoculation dans la chambre anté- rieure de l'œil, donne des résultats sensiblement identiques. Ily a donc lieu de penser que les bacilles ne se multiplent pas dans le corps de l'animal, ni au point inoculé, ni ailleurs. L'absence de généralisation du bacille spécifique chez les animaux inoculés avec les cultures pures concorde entièrement CONTIIIBUTION A L'ÉTUDE DU TÉTANOS. 13 avec les faits observés sur l'homme ou les animaux alteints de tétanos spontané; les organes de ces derniers ne contiennent, en effet, que très exceptionnellement l'agent pathogène. Mais tandis que, dans le cas de tétanos spontané ou provoqué par l'inocula- tion de la terre, le microbe végète dans la plaie provocatrice, aucune multiplication ne paraît se produire au niveau de la région inoculée avec les cultures pures. Enfin le pus ou les produits recueillis dans la plaie d'un tétanique sont inoculables aux animaux, sans qu'il soit possible cependant d'effectuer plus de deux ou trois passages; chez les animaux inoculés avec la dose de culture pure strictement suffisante, les produits recueillis après la mort, dans la région infectée, ne sont pas inoculables. Ces faits, en apparence contradictoires, recevront ultérieure- ment leur explication. III LE POISON TÉTANIQUE. Il est établi que chez l'homme ou l'animal, spontanément atteints du tétanos, l'agent pathogène ne se trouve constam- ment qu'au niveau de la lésion provocatrice; il ne pullule pas dans les organes. Pour expliquer comment une culture aussi restreinte dans une plaie souvent insignifiante peut déterminer les symptômes de la maladie, on a été conduit à supposer que le bacille tétanique sécrétait au foyer de sa végétation un poi- son extrêmement actif qui se répand dans l'organisme (Nico- laier, Rosenbach, Flûgge, Brieger, Nocard, etc.). L'existence de ce poison est facile à démontrer; à l'exemple de Knud Faber *, il suffit de le chercher dans les milieux nutri- tifs où le microbe a vécu. Si on filtre sur porcelaine une culture pure du bacille téta- nique en bouillon datant de 18. ou 20 jours, on obtient un liquide privé de tout germe, dégageant l'odeur caractéristique, à réac- tion franchement alcaline, et d'une toxicité considérable pour les animaux. Inoculé à des lapins, cobayes ou souris, sous la peau, dans les muscles, la cavité péritonéale, le sang, sous la 1. Knud Faber, Berl. Klin. Woch., -ISOO, n" 31. — Résumé d'un travail antérieur. li ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUll. dure-mère, il détermine sûrement un tétanos typique, mortel, ne différant en rien de celui que provoque l'injection des cul- tures vivantes. La dose active de ce liquide peut être réellement infinitésimale. Un cent millième de centimètre cube donne le tétanos à la souris. Un cinq centième, un huit centième de centimètre cube produit chez le cobaye un tétanos mortel en SO ou 60 heures ; il suffit même de un millième de centimètre cube pour tuer l'animal en trois jours. Les effets sont nuls lorsqu'on fait pénétrer le liquide par la voie digestive. Le produit de la filtration des cultures contient donc une substance chimique qui. en Fabsence du microbe vivant, déter- mine chez les animaux une intoxication mortelle; la maladie produite par la toxine seule, agissant à dose extrêmement faible, ne dillère en rien, ni par les symptômes, ni par l'évolution, de celle que provoque l'inoculation du bacille tétanique lui-même. Le tétanos de l'homme et des animaux est, en réalité, comme l'avaient pensé les premiers observateurs, une intoxication cau- sée par le poison que le bacille sécrète au foyer si restreint de sa culture; de là ce poison se diffuse dans l'organisme. Sa diffu- sion est probablement très rapide. Si on injecte une goutte ou une fraction de goutte de liquide filtré vers l'extrémité terminale de la queue d'un rat, c'est-à-dire dans une région où le tissu conjonctif est très dense et peu propice à une prompte absorp- tion, on peut, trois quarts d'heure après l'inoculation, section- ner l'organe à 2 ou 3 centimètres au delà du point infecté, sans que l'évolution ultérieure de la maladie soit sensiblement modi- fiée; l'animal meurt presque aussi rapidement que le témoin. Toutes les cultures en bouillon sont loin de donner des liquides d'une égale toxicité, lors même qu'elles sont faites avec une semence unicjue, et dans des conditions semblables d'ana- érobiose, de température, de durée, etc. La composition du iiiilieu nutritif infiue sur la quantité ou l'activité du poison éla- boré par les microbes, et ce ne sont pas toujours les cultures les plus luxuriantes qui fournissent la toxine la plus active. Les bouillons très nutritifs, additionnés de peptone, de glucose ou de maltose, conviennent le mieux à une pullulation rapide et abondante du bacille, mais la toxicité de ces liquides est nota- blement inférieure à celle des cultures moins prospères que l'on CONTRIBUTION A LÉTUDE DU TÉTANOS. 15 oblient dans un bouillon de bœuf ou de poule préparé avec uue partie de viande et deux parties d'eau. Dans le sang- en nature et le sérum frais, après une végétation maigre et en apparence difficile, le microbe produit un poison d'une activité considé- rable. Oïl peut, par un artifice, augmenter d'une manière remar- quable la toxicité des cultures en bouillon; il suffit d'utiliser ce fait que le microbe se développe facilement dans un milieu où une première génération a déjà vécu et élaboré son poison. Une culture en bouillon de bœuf peptonisé et glycosé à i 0/0, datant de 20 jours, donne, après filtration, un liquide (jui tue le cobaye à la dose minima de 1/l.jO de centimètre cube. L'ensemencement de bacilles jeunes dans ce liquide est suivi d'une culture très abondante: filtrée au 18'" jour, elle tue le cobaye au 1/500 de centimètre cube. Dans le liquide ainsi obtenu, il n'existe plus de substances nutritives pour un nou- veau développement du microbe, car l'ensemencemeiil reste infécond; mais si on y ajoute une faible quantité de bouillon neuf (20 " pour 3.j0 ^"^ de la culture ancienne), la troisième vé^.étation est encore assez abondante. Les microbes toutefois sont restés en grande partie filamenteux ou présentent des formes d'involution : les spores sont rares. Cette culture filtrée au 16« jour donne un liquide qui tue le cobaye au millième de centimètre cube (peut-être même à dose moindre; et la souris au cent millième de centimètre cube. La quantité de toxine contenue dans une si minime fraction du liquide filtré est difficile à apprécier; peut-être cependant les cbiffres suivants en donneront-ils une idée approximative. Un centimètre cube de ce liquide si actif, évaporé dans le vide, donne un résidu sec de 0^'',040. Soumis àla calcination, ce résidu subit une perte de 0'^'",02.j représentant le poids de la matière organique. Si l'on admet, chose évidemment inexacte, que ces 2o milligrammes appartiennent intégralement à la toxine elle- même, il ressort que ce poids de matière organique permettrait de tuer mille cobayes au moins ou cent mille souris; la dose mortelle serait donc, pour un cobaye, de 0^'", 000, 025, et pour une souris de 0s'",000,000,25 ! Est-il besoin de dire que dans ces 25 milligrammes de matière organique entrent pour une très large part des substances étrangères au poison tétanique, et 16 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. dont l'une sera signalée ultérieurement. Combien, en vérité, doit être minime, si même elle est pondérable, la dose réelle de toxine capable de donner la mort! De tels chiffres serviront au moins à placer sous son vrai jour l'incroyable activité des poisons fabriqués par les microbes dans les milieux de culture artificiels, activité probablement inférieure encore à celle des substances qu'ils élaborent dans l'organisme malade. Ajoutons aussi que la quantité de matière active dissoute dans un liquide filtré ne représente pas la totalité de la toxine sécrétée par le microbe dans la culture, car la porcelaine en a retenu une portion notable '. Peut-être serait-il plus exact de dire que les bacilles adhérents à la surface du filtre conservent dans leur proloplasma une quantité encore g^rande de toxine. Nous avons, en effet, des raisons de croire que la cellule microbienne garde dans son intimité même le poison élaboré, et qu'elle le cède au liquide ambiant par un phénomène de dialyse. Quelle est la nature du poison tétanique ? Est-il une ptomaïne, ou bien une de ces substances analogues aux diastases que les belles études de MM. Roux et Versin sur la diphtérie nous ont fait connaître? M. Brieger avait cru naguère pouvoir affirmer quele bacille du tétanos élaborait des ptomames diverses. Opérant sur des cultures impures faites dans de la viande de bœuf, de la rate de , mouton, de la cervelle hachée, il était parvenu à extraire, à l'état I de chloroplalinates, plusieurs composés dont les bases recevaient 1 le nom de télanine^ tétanoto.rine , spasmotoxine, et qu'il considérait comme les agents de l'empoisonnement. En formulant, il y a quelques mois à peine, une opinion nouvelle sur la nature du poison tétanique, M. Brieger nous a dispensés de toute critique à l'adresse de ses premières recherches et de celles de ses imita- teurs, Verrhoogen et Baert, qui, pour isoler le poison, commen- cent par le soumettre à une ébuliition prolougée, moyen sûr de 1. Après avoir filtré une culture en bouillon, on soumet la bougie à un lavage prolongé afin d'entraîner la toxine qu'elle peut contenir dans sa cavité. On 1 im- merge ensuite pendant ii iieures dans 230 grammes d'eau stérile que l'on filtre sur la bougie après ce délai; l'eau ainsi recueillie renferme assez de substance active pour tuerie cobaye à la dose de 1/30 de centimètre cube. La bougie est de nouveau plongée dans 2o0 gram;nes d'eau stérile que l'on filtre 12 heures après; le produit (le ce nouveau lavage tue encore le cobave ù la dose de 1/8 de centimètre cube. CONTRIBUTION A L'ÉTUDE DU TÉTANOS. 17 le détruire. Dans le même ordre d'idées, MM. Kitasato et Weyl ' ont décrit récemment les procédés compliqués qui leur ont permis d'extraire des cultures pures deux composés ptomaïques: l'un, un cliloihijdrale de tétaniue provoquant à la dose considéra- ble de 0^'',OoàO^'", 1, chez la souris, des symptômes peu compara- bles à ceux du tétanos; l'autre un composé de tétanotoxine qui tuait les souris avec des phénomènes paralytiques. On conviendra qu'il y a loin du prétendu poison tétanique isolé par les deux auteurs précédents à la substance que contien- nent les liquides de filtration, si active malgré son mélange, et tuant par tétanos typique à dose impondérable ; MM. Kitasato et ^Yeyl lont d'ailleurs reconnu. Il est donc certain que les ptomaï- nes signalées jusqu'à ce jour n'ont rien de commun avec le véritable poison tétanique. Des travaux de MM. Roux et Yersin sur la diphtérie était résultée une orientation nouvelle pour les recherches sur les produits toxiques que sécrètent les microbes. Inspiré par ces notions, Knud Faber étudia les propriétés générales de la matière active contenue dans les cultures filtrées du bacille tétanique, et, bien qu'agissant sur des pi'oduits impurs, parvint à déter- miner ainsi sa véritable nature ; il établit qu'à l'instar des venins, le poison tétanique demeure sans effet lorsqu'il est in- uit parla voie digestive ; qu'un chauffage à 65*' le détruit; que par l'ensemble de ses propriétés biologiques il présente de grandes analogies avec la jéquiritine, les enzymes ou ferments inorganisés. Ultérieurement, MM. Brieger et Frânkel attribuent au poison tétanique la composition des matières albuminoïdes et lui donnent le nom de toxalbumine. Tizzoni et Caltani essayent d'isoler ce poison, sans y parvenir, mais de leur étude intéres- sante ils concluent également à sa nature albuminoïde et à son analogie avecles zymases ou ferments solubles. Nos recherches, inspirées aussi par celles de MM. Roux et Yersin, établiront combien est étroite la parenté qui relie le poison de la diphtérie à celui du tétanos ; elles confirmeront l'opinion émise par Knud Faber, Tizzoni et Gattani sur la nature diastasique probable de ce dernier. La substance toxique contenue dans les cultures du tétanos 1. Kitasato et Weyl, Zeilsch. {. Hyy., 1890. 18 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. est modifiée ou détruite par raction de températures n'excédant pas 60°. Un liquide filtré qui lue rapidement le cobaye au 1/200 de centimètre cube, est considérablement atténué lorsqu'on Je chauffe, envase clos, pendant 40 minutes à 60°, ou 20 minutes à62"; injecté au cobaye à la doseénorme de un demi-centimètre cube, il tue Tanimal eniouo jours. Un chauffage do -SO minutes à 65°, envase clos, le rend inactif; les cobayes auxquels on en injecte un centimètre cube, et plus, n'éprouvent aucun trouble immédiat ou consécutif. Conservé en vase clos, à l'abri de l'air et de la lumière, le liquide filtré garde pendant longtemps toute son activité ; après quatre mois son pouvoir toxique estégalàce qu'il était au moment de lafiltration. Exposé à l'air, en couche mince, dans un matras Pasteur, il perd de son activité, après un mois, et tue avec un long- relard lorsqu'on l'injecte à la dose minima. Cette action de l'air est plus rapide et plus profonde lorsqu'elle s'exerce à la lumière solaire. Un liquide qui lue le cobaye au 1/200 de centimètre cube est in- clus, en couche de un centimètre d'épaisseur, dans un vase conique à large ouverture, simplement fermé par un tampon de ouate. Après sept jours d'exposilion à la lumière dilfuse, sur lesquels on compte 32 heures d'insolation (Lempérature maxima de l'inté- rieur des vases 34°), ce liquide se montre inactif lorsqu'on l'inocule à la dose de 1/4 de centimètre cube à un très jeune cobaye. Le même liquide exposé à la lumière dilfuse et solaire, mais en tube clos et sans air, n'avait sensiblement rien perdu de son activitépremière aprèsl4 jours, dont 50 beures d'insolation. L'acidification du liquide au moyen de l'acide tartrique ne modifie pas son pouvoir toxique. Evaporé dans le vide, sur l'acide sulfuj'ique et à la tempéra- ture ordinaire, le liquide filtré laisse un résidu brun, amorphe, conservant l'odeur propre aux cultures, et extrêmement toxique. L'alcool à 90° dissout une très faible quantité de ce résidu et laisse, après évaporation, une substance blanc grisâtre, qui exhale une odeur vireuse rappelantcelle des vieilles pipes, et dont une partie cristallise àl'air. La substance soluble dans l'alcool n'a pas de propriétés toxiques: l'extrait alcoolique fourni par cinq centimètres cubes d'un liquide extrêmement actif a pu être injecté en totalité sons la peau d'un cobaye sans que l'animal en ait CONTRIBUTIOxM A L'ETUDE DU TETANOS. 19 ressenti le moindre dommage. Le poison télanique est donc insoluble dans l'alcool. La partie du résidu que l'alcool n'a pas dissoute se présente, après dessiccation, sous forme de masses amorphes, ambrées, inodores, très solubles dans l'eau; inoculée au cobaye, elle lui donne un tétanos typique et morlel. L'alcool la précipite de sa solution aqueuse sous forme de flocons grisâtres. La substance active contenue dans le résidu, dialyse avec une certaine lenteur'. On ne peut qu'être frappé des analogies qui existent jusqu'ici entre les caractères du poison diphtéritique et ceux de la toxine du tétanos; celte ressemblance s'affirme encore par un autre trait commun. Comme le poison diphtéritique et comme les diastases, la toxine du tétanos a la propriété d'adhérer à certains précipités que l'on produit dans le liquide oii elle est contenue, C'est ainsi queles précipités de phosphate de chaux ou d'alumine entraîtient, mais en partie seulement, cette substance active. Insérés sous la peau des cobayes, après avoir été soigneusement lavés à l'eau distillée stérile, ces précipités déterminent un tétanos intense, typique, mortel en 30 ou 36 heures; un volume du précipité encore humide, égal à celui d'une tète d'épingle, suffit pour obtenir ce résultat. Cependant le phosphate de chaux ou l'alu- mine n'a pas dépouillé le liquide, sur lequel on opère, d'une grande quantité de sa toxine, car après six précipitations succes- sives, il reste encore très actif. i. Un gramme de résidu, encore humide, provenant d'un liquide très actif, est dilué dans 2'j centimètres cubes d'eau distillée stérile que l'on place dans le vase extérieur d'un appareil à dialyser. Sur le dialyseur, on verse 6 centimètres cubes d'eau distillée qui serviront pour les inoculations à faire. Le tout est recouvert d'une cloche et mis à la glacière. A des intervalles différents, on prélève de l'eau con- tenue dans le dialyseur pour l'injecter à la dose toujours égale de Vô de centi- mètre cube sous la peau de l'abdomen de cobayes; les résultats des inoculations successives ont été les suivants : /près 4 heures Effet nul. Après 20 heures Pleurosthotonos apparaissant au ic jour; pas d'autres symp- tômes tétaniques. Guérison. Après 40 heures Pleurosthotonos le 3e jour qui suit l'inoculation, puis tétanos de moyenne intensité ; gui'rison après 12 jours. Après .3 jours Pleurosthotonos survenant le 2e jour; tétanos généralisé. Mort le 7« jour. Après 5 jours Début du tétanos le ie jour ; tétanos généralisé : mort le 7c jour. Après 7 jours Tétanos généralisé débutant le 2e jour; mort le 10e jour. Après 12 jours Tétanos généralisé; mort le 5e jour. 20 ANNALES DE LINSTITUT PASTEUR. Desséchés dans le vide, les précipités gardent pendant long- temps leur toxicité: le poison qu'ils ont retenu résiste mieux sous cette forme à l'action de l'air. Alors que le liquide filtré perd de son activité après un mois, et que, déjà avant ce délai, le précipité humide cesse d'être nocif, un précipité de phosphate de chaux desséché et conservé à l'air depuis plus d'un mois, a produit sur le cobaye un tétanos mortel en 5 jours. La quantité de matière organique qui adhère au précipité est toujours extrêmement faible. Un milligramme du phosphate de chaux, dont il est parlé, est soumis à la calcination; la perte au -rouge,représentant le poids de la matière organique, est inférieure à 3/10 de milligramme. Or, un demi-milligramme de ce même précipité suffit à donner au cobaye un tétanos mortel; la matière organique contenue dans ce poids minime est donc approxima- tivement de 0"', 00015: encore est-il bien certain que cette matière est loin d'être la toxine pure. Des faits exposés ci-dessus, il ressort que la toxine du téta- nos ne présente aucun des attributs propres aux ptomaïnes, aux alcaloïdes; par l'ensemble de ses caractères, elle se rapproche du poison diphtéritique dont MM. Roux et Yersin ont établi les analogies frappantes avec les diastases ou encore les venins. Comme les diastases, le poison tétanique est détruit par la cha- leur à des températures peu élevées, par l'action de l'air et de la lumière solaire; il est précipitable par l'alcool; il adhère à cer- tains précipités. Gomme les venins, il agit à dose impondérable et n'exerce aucun effet lorsqu'on l'introduit par les voies diges- tives. Ainsi que l'ont fait observer MM. Roux et Yersin, cette assimilation d'une toxine aux diastases ne vise point une com- munauté d'action chimique, car pas plus que le poison de la diphtérie, celui du tétanos ne digère Talbumine, la fibrine ou n'intervertit le sucre; elle tend seulement à établir que les sub- stances toxiques élaborées par les ag"ents pathogènes des deux maladies présentent un ensemble de propriétés appartenant aussi aux diastases, et que peut-être les unes et les autres ne diffèrent pas essentiellement. Substance diastasique élaborée par le bacille du tétanos. Les cul tures en bouillon du bacille tétanique contiennent une substance qui agit nettement à la manière des ferments digestifs. Si, dans un tube de gélatine ordinaire, on verse une petite quantité d'un GONTRUiUTION A L'ETUDE DU TETANOS. 21 liquide provenant d'une culturo de IS à 20 jonrs filtrée sur por- celaine, on voit, après un délai variable selon la température à laqnelle se fait l'expérience, le milieu primitivement solide, perdre sa consislance dans les parties en contact avec le liquide, se iluidifier ensuite graduellement, par tranches, quelquefois jus- qu'à liquéfaction totale de la masse. Cette transformation se produit très lentement à la température de 15°; à 20-2o^ elle n'exige guère que 13 à 20 jours pour s'accomplir, et devient extrê- mement prompte àla température de 37". Un mélange de deux par- lies de gélatine pour une partie de liquide filtré, mis en tube clos à l'étuve à 37°, cesse déjà de faire prise après 24 ou 3G heures, et reste ensuite définitivement fluide. Dans tous ces cas, le milieu nutritif garde sa limpidité et sa transparence; il n'y a pas eu développement d'organismes auxquels on puisse imputer la liqué- faction observée : celle-ci a donc été produite par une véritable diastase que le microbe a élaborée dans sa culture. L'intérêt du fait ne gît pas dans sa simple constatation; il était d'ailleurs à prévoir, puisque le développement du bacille sur la gélatine détermine la liquéfaction de ce milieu. Mais, il y avait lieu de se demander si la toxine et cette diastase qui liquéfie la gélatine n'étaient pas une seule et même substance; cer- taines particularités, du moins, semblaient l'indiquer. Nous possédons, en eftet, plusieurs échantillons de bacilles du téta- nos, entièrement dénués de virulence, qui croissent sur la géla- tine sans la liquéfier, ou provoquent dans ce milieu une diminution de consistance à peine sensible : en perdant l'apti- tude à fabriquer le poison, ces bacilles ont aussi perdu celle d'élaborer la diastase dont il s'agit. D'autre part, cette diastase, contenue dans les liquides filtrés, présente un ensemble de caractères communs à la toxine. Elle est modifiée ou détruite par des températures peu élevées ; un chauffage de 13 minutes à 43° diminue déjà son action ; un chauffage de 13 minutes à55° suffit à l'anéantir. Elle s'altère, puis perd totalement ses pro- priétés par l'exposition à l'air, à la lumière solaire. Un liquide filtré qui, après insolation au contact de l'air, est devenu inactîf sur les animaux, est aussi incapable de liquéfier la gélatine ; par contre, un liquide qui, malgré 50 heures de l'action du soleil, mais à l'abri de l'air, a conservé tout son pouvoir toxique, resle également apte à fluidifier la gélatine. Enfin, de même que la 22 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. toxine agit également bien en milieu alcalin et en milieu acide, de même la diastase détermine la liquéfaction de la gélatine en milieu acide comme en milieu alcalin. Ce parallélisme singulier entre les propriétés de la toxine et celles du ferment diastasique ne suffit pas à établir l'identité des deux substances ; il ne permet pas d'affirmer que toxine et diastase liquéfiante sont un seul et même corps, agissant comme poison dans l'organisme vivant et comme ferment digestif sur la matière organique morte. Le fait suivant semble bien l'établir. Un mélange de deux parties de gélatine pour une partie de liquide filtré, de virulence connue, est inclus dans une série de tubes clos que l'on porte à l'étuve à 37". Si, à des jours différents, on recherche ce qu'il est advenu de la toxicité du mélange, on voit que, après 2, 4, 10 jours d'action sur la gélatine, le liquide ajouté a conservé son activité intégrale; il tue à la même dose minima qu'auparavant. La quantité de toxine n'a donc pas dimi- nué, ce qui, vraisemblablement, devrait être si toxine et diastase digestive étaient un seul même corps. On conçoit, en effet, que pendant l'action chimique sur la gélatine, il a dû disparaître une dose de diastase adéquate à la masse actionnée; or cette dispa- rition ne paraît en aucune façon porter sur la substance toxique. Dans le cours de ce travail, i) a été fait plusieurs fois allu- sion aux analogies que présentent la diphtérie et le tétanos: les points de contact sont, en effet, si nombreux et si exacts entre les deux maladies qu'elles deviennent pour ainsi dire superpo- sables. Toutes deux sont produites par un microbe qui se cul- tive en un point fort restreint de l'organisme, ne franchit pas les limites de la lésion locale, ne se généralise pas. Dans l'un et l'autre cas, l'agent pathogène élabore au foyer si limité de sa vé- gétation une substance chimique d'une extrême activité qui se répand dans l'organisme, et que l'on retrouve aisément dans les cultures. Les deux microbes agissent donc à distance par l'inter- médiaire d'un poison : la diphtérie et le tétanos sont éminem- ment des maladies d'intoxication. La toxine produite par le ba- cille du tétanos est exactement comparable à la toxine sécrétée par le bacille diphtérique : mêmes propriétés essentielles per- mettant de les assimiler aux diastases. La différence intervient dans l'action propre à chacune d'elles. Le poison diphtérique CONTRIRUTION A L'ETUDE DU TÉTANOS. ?3 exerce des eiïets immédiats ou à long- terme; il piMil agir sui- des tissus d'ordre divers, appareil vasciilaire, système nerveux, parenchymes, tissu conjonctif, tissu épilhélial, et produire des lésions multiples (œdèmes, liémorr;igies, exsudais séreux, nécrose, néphrite, paralysies). Le poison tétanique, au con- traire, ne paraît avoir que des effets immédiats qui se limitent au système neuro-musculaire. Il nous serait difficile d'élahlir d'ores et déjà la physiologie pathologique de l'intoxication tétanique; nous nous bornerons à poser ici les questions qu'elle soulève. Si, chez un animal atteint de tétanos généralisé, on détruit g-raduellement la moelle par l'introduction d'une tige flexible dans le canal vertébral, on fait progressivement disparaître les contractures et les spas- mes dans les membres innervés par les y)ortions détruites de l'axe spinal. De même, si chez un animal dont le renflement lombaire a été préalablement détruit, on inocule dans les mem- bres postérieurs une dose suffisante de toxine pour produire sû- rement un tétanos g^énéralisé, on voit les pattes postérieures rester flasques et inertes, alors que toutes les parties du corps en rapport avec la portion intacte du névraxe sont rigides et con- tracturées, et que le témoin inoculé de la même manière est atteint de tétanos général. Enfin le tétanos n'intéresse pas les groupes musculaires dont les nerfs ont été sectionnés. Ces ex- périences, renouvelées de celles qui ont conduit Mag-endie à éta- blir la localisation élective de la strychnine sur la moelle épi- nière, semblent permettre la même conclusion en ce qui concerne la toxine tétanique. Mais il est d'autres faits que l'action exclusive du poison sur la moelle ne suffirait peut-être pas à expliquer. Tel est le début constant de la maladie par les muscles intéressés dans l'inoculation ou les plus voisins du point infecté ; l'extension hémilatérale des symptômes du ce ; inoculé, et parfois leur limi- tation exacte à une moitié du corps. Telle est surtout la localisa- tion absolue du tétanos à un g-roupe de muscles, lorsque la dose de toxine injectée dans un membre est extrêmement faible; on peut même déterminer la contracture isolée et durable d'un seul muscle. La toxine se comporte alors comme un poison muscu- laire. 1 2i ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. IV » , A L ETAT DE PURETE, LE BACILLE TETANigUE ET SES SPORES NE SE DÉVELOPPENT PAS DANS LES TISSUS VIVANTS ET SAINS. CON- DITIONS QUI EMPÊCHENT OU FAVORISENT LEUR DÉVELOPPEMENT. Les cultures inoculées n'agissent que par la toxine quelles con- tiennent. — Tous les auteurs qui ont étudié jusqu'ici le tétanos expérimental obtenu par l'inocuialion de cultures pures parais- sent accepter que la maladie a pour cause la pullulation du ba- cille spécifique au point infecté. C'est ainsi que M. Kilasato s'est préoccupé d€ savoir si, et en combien de temps, l'agent patho- gène produisait une substance toxique au sein de l'organisme vivant. Pour l'établir, il inocule plusieurs souris à la racine de la queue, résèque la région inoculée après 30 minutes, 1, 2, 3, 4 heures, etc., puis cautérise au fer rouge la plaie de section. Il observe alors que la souris dont la queue a été sectionnée 30 mi- nutes après l'infection, survit seule; toutes les autres meurent tétaniques, et, en examinant au microscope la région inoculée, il constate que 8 ou 10 heures après l'inoculation on n'y trouve plus de bacilles. Ceux-ci, dit-il, disparaissent donc très rapide- ment lorsqu'ils sont injectés en cultures pures, mais, avant leur disparition, ils produisent un poison chimique très actif. Plus affirmatifs, MM. Sanchez Toledo et Veillon admettent que le bacille tétanique se développe dune façon constante au point d'inoculation, qu'il peut même passer dans le sang de la circu- lation générale aux dernières heures de la vie. Si la multiplication du bacille au point où il a été introduit est réelle, il faut convenir que cette culture est rapide et courte, puisque, de l'avis môme des auteurs précédents, les microbes cessent d'être visibles après 8 ou 10 heures (Kitasato) et que, si on les rencontre, ils sont toujours en très petit nombre (Sanchez Toledo et Veillon). Nous avons très rarement réussi, après la mort de l'animal, à les déceler au point d'inoculation par l'examen microscopique. Il est même impossible de saisir CONTRIBUTION A LETUDE DU TTEANOS. 25 sur le fait une période de culture fugace, si tant est qu'elle, existe. Nous avons déjà mentionné que, chez le lapin, l'exaraen de la région inoculée, pratiqué pendant les heures qui suivent l'infection, ne montrait d'autre particularité que la diminution considérable et très rapide du nombre des bacilles. Ou peut s'en convaincre d'une manière plus facile et plus saisissante encore en recourant à l'inoculation dans la chambre antérieure de lœil du lapin ou d'un animal très sensible, comme le cobaye. Qu'il s'agisse de l'un ou de l'autre animal, les résul- tats sont identiques : lorsque, à des périodes variables de 3 à 18 heures après l'inoculation d'une goutte de culture dans l'œil, on prélève de l'humeur aqueuse pour l'examiner, c'est à peine si, après 4 ou 6 heures, ou y rencontre quelques microbes libres; passé le délai de 6 heures, il est généralement impossible d'en trouver, même lorsque l'inoculation a été faite avec une goutte d'une véritable purée de bacilles. Signalons, sans y insis- ter pour rinstant, cette particularité remarquable, en contradic- tion formelle avec les faits connus pour les autres microbes pathogènes, que le bacille du tétanos ne se développe pas, durant la vie, dans l'humeur aqueuse d'animaux sensibles à la maladie. Tout concourt à établir que, loin de se multiplier, le bacille disparaît rapidement de la région infectée; on sait d'autre part qu'il ne végète pas dans le sang et les viscères. Et cependant l'animal auquel on inocule une culture pure meurt du tétanos. Etant donné l'extrême activité de la toxine contenue dans les cultures, on est conduit à penser que les animaux succom- bent alors aux elfets du poison élaboré in vitro par le bacille, plutôt qu'aux conséquences du séjour et de la vie du microbe lui-même dans les tissus, La distinction est exacte, et, de plus, facile à vérifier. Une dose infinitésimale, l/oOO, 1/1000 de centimètre cube de liquide filtré, privé de microbe vivant, pro- voque chez le cobaye un tétanos aussi meurtrier que celui qui succède à l'injection de doses cent ou deux cents fois plus grandes de culture intégrale; ne doit-on pas supposer que les doses de culture habituellement employées par les expérimen- tateurs renferment une quantité de toxine suffisante à elle seule pour tuer ? D'autre part, si on inocule simultanément des ani- 26 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. maux, les uns avec une culture ordinaire, les autres avec le pro- duit de filtration de cette même culture, à dose égale, tous les animaux succombent dans un délai sensibJement le même et avec des symptômes identiques. Enfin, l'expérience précitée de M. Kitasato peut être rig-oureusement reproduite en opérant, non plus avec une culture vivante, mais avec un liquide filtré. Deux lots de quatre rats blancs sont inoculés à la partie moyenne de la queue, l'un avec une culture en bouillon datant de trente jours, l'autre avec le liquide filtré de cette même culture ; la dose injec- tée est égale dans les deux cas (1/15 de centimètre cube). A trois rats de chaque lot on sectionne ensuite la queue au voisi- nage de la base et à des périodes variables après l'inoculation, 45 minutes, 2, 3 heures; le quatrième rat sert de témoin pour chacun des groupes. Tous les animaux succombent à un tétanos typique dont le début et l'évolution ne semblent guère influencés pas l'ablation plus ou moins précoce de l'organe infecté; cepen- dant l'apparition du tétanos a été plus rapide et la mort plus prompte chez les rats inoculés avec la culture filtrée que chez les rats inoculés avec la culture vivante. On peut donc supposer que, dans les conditions habituelles de l'expérimentation, c'est la toxine des cultures qui donne le tétanos et non celle que le microbe peut élaborer dans les tissus. La preuve qu'il en est ainsi, c'est que le microbe lui-même n'intervient pour rien dans la production delà maladie. En effet, si on inocule des cultures ne contenant pas de toxine parce que le bacille ne l'a pas encore sécrétée, le tétnnos ne se manifeste pas. Nous avonsdéjà fait allusion à ce singulier résultat. Lorsque la culture du bacille s'effectue à une température do 20-22", le microbe se développe assez bien, mais ne fabrique son poison que tardive- ment. On peut donc, en utilisant ces cultures à un moment con- venablement choisi, disposer d'un microbe bien vivant, envoie d'activé végétation, mais dégagé de toxine; lorsqu'on l'inocule à des animaux très sensibles comme le cobaye, à dose même consi- dérable, l'animal ne présente ni immédiatement, ni ultérieure- ment aucun signe de tétanos. C'est ainsi que nous avons pu injecteràdejeunes cobayes 1/4, l/3decentim.cubed'uneculturede 5 jours faite en bouillon à la température de 22'», et très riche en bacilles, sans déterminer aucun trouble appréciable; un demi- centimètre cube de la même culture a simplement produit une CONTUnUJTION A L'ÉTUDE DU TÉTANOS. 27 raideur légère et fiigaco des muscles dorso-lotnhaires. De même l'inoculation de cultures en gélatine âg-ées de 5 h C jours et non encoreliqnéfiées, n'a provoqué aucun symptôme tétanique chez le cobaye. N'est-il pas surprenant de voir ce microbe pathogène n'exercer aucun efïet sur l'organisme? La dose inoculée peut être considérable, le nombre des bacilles réellement prodigieux; de plus ceux-ci sont jeunes, en pleine voie de développement et cependant ils ne prospèrent point dans les tissus, ils disparais- sent sans avoir eu le temps de sécréter leur toxine '. Le résultat est identique si on inocule des quantités, même très grandes, de spores sans toxine. Un centimètre cube d'une culture ne contenant plus que des bacilles sporulés peut être injecté sans dommage au cobaye, lorsque la culture a été préala- blement chauffée à 6;i<» pendant 20 minutes. Cette température rend la toxine inactive sans altérer les spores; ensemencées, elles germent et donnent un liquide très toxique : chez l'animal ces spores ne se développent pas. Mais peut-être eslimera-t-on que les spores n'évoluent pas parce qu'elles ont été afTaiblifS par le chauffage. Au lieu de détruire la toxine au moyen de la chaleur, on peut l'entraîner par un lavage abondant et rapide à l'eau stérile qui a l'avantage de ne pas altérer d'une manière appréciable la vita- lité des spores. Ainsi débarrassées de leur poison, ces spores ne donnent plus le tétanos lorsqu'elles sont introduites avec pureté dans l'organisme d'un animal sain. On recueille par décantation la totalité du dépôt d'une cul- ture dans 250''' de bouillon, âgée de 20 jours, et dont l'activité est telle qu'il suffit de 1/400 de centimètre cube pour tuer un cobaye en 3 jours. Ce dépôt est soumis, à l'abri de toute conta- mination, à un lavage de 24 heures dans 6 litres d'eau stérile ^ ; ■1. On ne saurait penser qu'il s'agit ici d'un microbe atténué par les conditions dans lesquelles s'est effectué son développement. Les cultures en bouillon ou en gélatine, qui se montrent inactives lorsqu'on les inocule au o'-" ou Ge jour, devien- nent très rapidement actives; au -lO^ jour elles tuent ii la dose de 1/13 de centi- mètre cube, et sont encore plus toxiques au do" ou "20e jour. Le microbe inoculé n'avait donc rien perdu de son aptitude à élaborer le poison. 2. Le procédé de lavage auquel nous avons eu recours est le suivant. Une bougie Cbamberland est sectionnée à S ou 4 centimètres de son fond. Dans le culot ainsi obtenu et préalablement stérilisé, on introduit la culture ou le dépôt de cul- ture, puis on le relie au moyen d'un embout et d'un tube épais en caoutchouc à la tétiae d'une bougie ordinaire filtrant par pression. Grâce à ce dispositif, il est facile de laver laculture contenuedans le culot avec telle quantité que l'on voudra 29 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. après lavage il est récolté intégralement et délayé dans 4 *■'' d'eau également stérile. On obtient ainsi un liquide boueux, une véri- table purée extraordinairement riche en microbes sporulés, puis- qu'elle contient la totalité des bacilles qui se sont développés pendant 20 jours dans 250 ""^ de bouillon. Ces spores sont bien vivantes ; ensemencées, elles donnent rapidement une culture dont l'activité est grande, comme le démontre l'inoculation à l'animal. A des cobayes on injecte des doses variables de celle purée microbienne, allant jusqu'à 1/3 de centimètre cube, sans que les animaux présentent, soit immédiatement, soit par la suite, aucun symptôme de tétanos. Et cependant, dans la minime fraction de ce liquide que peut contenir une anse de platine^ il existe une telle abondance de spores que l'on doit évaluer à des milliards le nombre de celles qui ont été intro- duites sous la peau de chaque animal. Les myriades de bacilles contenues dans le dépôt soumis au lavage avaient élaboré au sein de la culture une quantité de toxine suffisante pour donner le tétanos et la mort à 100,000 cobayes; la douzième partie des spores formées par tous ces microbes est injectée à un seul cobaye et ne réussit pas à sécréter la dose de poison suffisante pour le rendre malade. Peut-on fournir une preuve plus saisis- sante que les spores du bacille tétanique introduites seules, avec pureté, sous la peau d'un animal très sensible comme le cobaye sont incapables de germer et de provoquer la maladie, bien qu'elles soient placées dans les meilleures conditions d'anaé- robiose! Cette résistance de. l'animal a toutefois une limite, car si on lui inocule une dose équivalente au quart ou au huitième du dépôt recueilli, il succombe à un tétanos rapide. Ainsi se trouve établie la part respective du microbe et de la toxine dans les effets consécutifs à l'inoculation des cultures pures. Le microbe ne se multiplie pas, il disparait rapidement des tissus où on l'injecte. Mais la toxine qu'il avait élaborée an- de l'eau pure débitée par la bougie supérieure, et cela ;i l'abri de toute impureté, et sans perte possible de microbes, puisqu'ils seront tous retenus sur les parois du filtre inférieur. Opérant avec le minimum de pression nécessaire à la filtration, on peut, en 48 ou 24 heures, faire passer 5 ou 6 litres d'eau sur le dépôt microbien : un tel lavage est en général suffisant pour entraîner la presque totalité de la toxine que les microbes retiennent à leurentour ou dans leur intimité. Lorsque le lavage est terminé, la paroi intérieure du culot est tapissée par un enduit de bacilles qu'il est aisé d'enlever avec un pinceau stérile. 1 CONTRIBUTION A L'ETUDE DU TÉTxVNOS. 29 térieurement in vitro et que la culture inoculée renferme, est toujours prête à agir avec la rapidité qui lui est propre; elle agit seule pour produire la maladie et la mort '. Une notion plus importante se dégage encore : le bacille tétanique ou ses spores, lorsqu'ils pénètrent seuls, môme en quautité considérable, dans les tissus d'un animal sain, ne se développent pas et demeurent nofîensifs. Oncomprend dès lors la non inoculabilité des produits prélevés chez un animal rendu tétanique par l'injection de cultures pures. II Les recherches expérimentales entreprises jusqu'ici au moyen des cultures pures se réduisent donc à une étude sur les pro- priétés du poison tétanique; elles ne fournissent aucun rensei- gnement sur le mécanisme véritable de l'infection telle qu'elle s'observe dans les conditions naturelles. Bien différentes, en effet, sont les circonstances réalisées au laboratoire par l'ino- culation des cultures, et celles que l'homme ou les animaux ren- contrent lorsqu'ils contractent spontanément le tétanos. Dans le premier cas, on injecte simultanément le microbe et une-dose de toxine suffisante pour tuer ; dans le second une plaie est souillée par des produits contenant des spores du bacille tétanique qui, avant de susciter la maladie, auront à germer et à sécréter le poison spécifique : les faits ne sont évidemment pas compa- rables. 1. Cette toxine peut être retrouvée, après la mort de l'animal, dans les humeurs el les tissus, mais seulement lorsque l'inoculation a été faite à dose copieuse. Avec 0'''-,o de sérosité pleurale ou de sang recueillis sur un lapin qui avait succombé à l'inoculation de l/2centiraètre cube de liquide filtré, M.Kitasatoa pu donner le tétanos à des souris. De même M. Bruscbessini, opérant encore avec la toxine seule (mention n'est point faite de la dosej, a trouvé dans le sang, la moelle, les reins des lapins, une quantité suffisante de poison actif pour provoquer, par l'injection de ces produits, le tétanos cbez d'autres lapins. Après l'inoculalion aux cobayes d'une dose de toxine inférieure à 1,8 de centimètre cube, nous n'avons jamais pu déceler la présence du poison dans le sang ou les organes. — Les faits expérimentaux de M.\I. Kitasato et Bruscbessini nous semblent en éclairer certains autrei, ceux de MM.. Sancbez Toledo et Veiilon, par exemple, qui ont réussi parfois à donner le tétanos en inoculant un fragment assez volumineux du tissu conjonctif excisé au point d'inoculation, une grande quantité de sang, la presque totalité du foie, de la moelle, etc., provenant d'animaux tués par l'injection de cultures à dose malheureusement non précisée. 30 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. Or il a été démontré que si l'on introduit avec pureté, dans des tissus d'un animal sain, des bacilles jeunes ou des spores privés de toxine, ces bacilles et ces spores ne produisent pas la maladie. Cependant il s'agit, en l'espèce, d'animaux comme le cobaye qui contractent facilement le tétanos lorsqu'on les infecte avec de la terre ou des produits recueillis dans la plaie d'un tétanique, lesquels sans nul doute ne comporteut jamais une proportion de germes équivalente à celle dont il a été t'ait usage dans les expériences précédentes. Il doit donc exister des conditions saisissables qui favorisent ou empêcbent la multiplication de l'agent pathogène au point où il pénètre. C'est ce que l'on peut établir. Lorsqu'on inocule avec pureté à un cobaye 1/4 ou 1/3 de centimètre cube du liquide, riche en bacilles sporulés, mais sans toxine, dont il a été parlé plus haut, Tanimal ne prend pas le tétanos. On peut provoquer la maladie avec uue dose beaucoup moindre. Si, après avoir mélangé 1/15 de centimètre cube du liquide précédent à 1/4 de centimètre cube d'une solution d'acide lactique au cinquième, on injecte le tout daus les muscles de la cuisse d'un cobaye, l'animal devient tétanique : les symptômes débutent par la patte inoculée, s'étendent rapidement aux autres membres, aux muscles de la nuque, et la mort survient le troisième jour après l'inoculation. Chez le lapin l'elfet sera le même. Pour donner le tétanos à cet animal avec des cultures pures très actives, il est générale- ment nécessaire d'inoculer des doses variant do 1/2 à 1 centimètre cube; des quantités considérables de microbessans toxine n'exer- cent sur lui aucune action. Mais on provoque la maladie en asso- ciant 1/8 de centimètre cube du liquide contenant les microbes sans toxine àl/4de centimètrecubedelasolutionlactique. L'injec- tion étantfaite dans un muscle de la cuisse, le tétanos débute au troisième on quatrième jour par le membre inoculé, se généralise, et tue vers le huitième jour après l'injection. L'acide lactique peut être remplacé par la tri-méthylamine à la dose de 4 gouttes; le lapin prend alors un tétanos très vio- lent, mortel en 8 jours. D'autres substances agiraient sans doute dans le même sens. Un simple traumatisme suffit à produire des effets identiques. A un cobaye, on fait une forte contusion d'un muscle de la CONTKlimTlON A L'ETUDE DU TETANOS. 31 cuisse (pression éiierj^ique à l'aide (fuiie pince;, sans plaie ex- térieure, et an poinl meurtri on injecte 1/15 de centimètre cube du liquide renfermant des spores sans toxine. 48 heures après, le tétanos débute par le membre traumatisé, et Tanimal meurt à la lin du troisième jour. Ainsi doue, comme dans les expériences bien connues de MM. Roux et Nocard sur le virus atténué du charbon sympto- matique, l'action sur les tissus d'un agent chimique (acide lac- tique, Iri-méthylamine), ou d'un traumatisme banal, permet l'infection par des spores qui, injectées seules ou dans un muscle sain, eussent été incapables de produire la maladie. L'association du micrubaviUiis prodigiosus aux spores du ba- cille tétanique n'est pas moins propre à favoriser l'infection. Un cobaye reçoit sous la peau de l'abdomen un mélange de 1/15 de centimètre cube du liquide renfermant des bacilles sporulés sans toxine, et de 0cc,5 d'une culture de microbaeiUns prodigmas en bouillon datant de un mois : 32 heures après débute un téta- nos qui se généralise avec une extrême violence et provoque la mort dans la oO*' heure qui suit l'inoculation. La culture du microbacillus prodigiosus a-t-elle agi par les produits solubles qu'elle renferme ou par les cellules vivantes du microbe? Cette dernière hypothèse paraît la plus plausible. En elfet, si ou associe les spores du tétanos à 0cc,5 du liquide résultant de la filtration sur porcelaine de la même culture du niicrobacillus prodigiosus , l'injection de ce mélange au cobaye n'est pas suivie de tétanos. De même, si on emploie une quan- tité ég-ale de cette culture chaulïée pendant 4 minutes à 100" ou bien à GO'' pendant une heure. Il y a donc, dans les cultures du mie. prodigiosus, un agent que le filtre arrête, que la chaleur détruit, et qui, ajouté aux spores du tétanos, facilite leur pouvoir pathogène. Cet agent parait être le microbacille lui-même, comme l'indique l'expérience suivante. Une culture du mie. prodigiosus. âgée de 3 jours, est lavée sur porcelaine par deux litres d'eau stérile, sui- vant le procédé déjà mentionné pour les cultures du tétanos; les produits solubles que le microbe a sécrétés sont ainsi éliminés. On mélange ensuite un peu de l'enduit retenu par le filtre à des spores tétaniques sans toxine (1/15 de centimètre cubej, et le tout est injecté sous la peau d'un cobaye ; soixante-douze heures après apparaisse il les premiers signes d'un tétanos qui se 32 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUll. généralise et lue l'animal le 6'^ jour après l'inuculation. L'évo- lution delà maladie est ici moins rapide que dans le cas où le mélange a été fait avec une culture intégrale du mie. prodigiosus , ce qui conduit à supposer que les substances élaborées par le microbe, la tri-mélhylamine surtout, jouent aussi un rôle pour favoriser l'injection tétanique; il n'en ressort pas moins avec évidence que l'action du micro-bacille seul, dégagé de tout produit de sécrétion, suffit à produire les mêmes effets. Une conclusion s'impose donc : seules, les spores du tétanos ne pouvaient germer ; accouplées à un microbe banal, elles végètent et provoquent la maladie. Des cobayes et des lapins témoins ont été toujours inocu- lés avec des doses supérieures du même liquide riche en spores sans toxine; ils n'ont présenté aucun signe de tétanos et restent encore bien portants après plusieurs mois. L'expérience relatée en dernier lieu laisse déjà soupçonner le rôle important qui peut être dévolu aux associations micro- biennes dans la pathog-énie du tétanos spontané; les faits sui- vants rétabliront sans conteste. Dans une logelte creusée aux dépens du tissu cellulaire sous- cutané de la région abdominale chez le cobaye, on introduit une petite boule de ouate stérilisée qui a été imprégnée de spores sans toxine (1/30 de centimètre cube de liquide employé). La plaie, non suturée, est laissée exposée aux souillures extérieures, ou bien, sans asepsie préalable, elle est partiellement réunie par un point de suture. Dans un délai variant entre 5 et 10 jours, l'animal présente les premiers signes d'un tétanos qui prog-resse rapide- ment et le tue en 28 ou 36 heures. L'expérience a été faite sur cobayes et 2 lapins, soit avec des cultures chauffées à 65°, soit avec des dépôts de cultures soumis au lavage. Tous ces ani- maux ont pris le tétanos plus ou moins rapidement; un seul a survécu après avoir présenté un tétanos chronique. Le moyen est donc sûr pour infecter les animaux avec des doses très faibles de microbes sans toxine. L'explication en est simple; elle découle naturellement de la particularité suivante, constamment relevée. Chez les animaux dont il s'agit, la plaie d'inoculation était toujours le siège d'une suppuration modérée CONTRiniTION A L'ETUDE DU TETANOS. 33 ou d'une irritation se traduisant par un suintement séro-puru- lent, quelquefois hématique. Dans lopus et les liquides issus de ces plaies existaient, en quantité variable, des organismes divers, microcoques, bacilles, surtout des microbes pyogènes. En rai- son des souillures faciles de la plaie, les spores du tétanos avaient cessé rapidement d'être à l'état de pureté. L'immixtion des microbes adventices réalisait dans ces expériences, sous des formes variées et complexes, l'association microbienne dont un type simple nous a été fourni par l'expérience faite avec le micr. prodigiosus; les conséquences de celle-ci éclairent suffisamment les conséquences de celles-là. Nous ne voulons pas dire que toutes les associations de ce genre puissent être également efficaces pour favoriser l'infection, ■car il n'est pas indifférent que tel ou tel microbe intervienne en pareil cas. Ce que le micr. prodigiosus et les bacilles ou micro- coques rencontrés dans les plaies des animaux précédents ont pu faire, ne sera peut-être pas réalisé par un autre organisme. Nos recherches dans ce sens n'ontpas été très étendues ; toutefois nous n'avons pas réussi à provoquer le tétanos chez les lapins en leur introduisant sous la peau des fragments de bois ou du sable imprégnés de spores tétaniques et de bacilles de Friedlander, de staphylococcus pijogenes aureus, de streptocoque, de bacillus subtilis. 11 faut donc admettre que certains microbes, qu'il serait peut-être intéressant de déterminer, ont seuls la propriété du faciliter l'évolution de l'agent pathogène dans les tissus. Toutes ces notions sont suggestives; elles permettent de mieux comprendre les faits qui se rapportent à fétiologie du tétanos spontané. Il ne suffira pas de la pénétration de l'agent pathogène dans forganismepour que la maladie s'ensuive : ainsi s'explique la rareté relative du tétanos, malgré l'ubiquité du microbe qui le provoque et la facilité avec laquelle il peut être apporté au contact des plaies. Diverses conditions, dont quel- ques-unes connues, sont nécessaires pour que l'infection se pro- duise : un trouble dans la vitalité des tissus où le bacille pénètre, l'état de la plaie qui le reçoit, surtout l'association avec certains microbes représentent autant de facteurs qui doivent jouer un rôle de premier ordre. Ainsi s'explique l'action tétanigène de la terre si riche en microbes divers qui aident au développement de 3 34 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. Tagent pathogène, et aussi à l'inoculabilité constante des produits recueillis dans la plaie des tétaniques, où le bacille spécifique est toujours mélangé à d'autres espèces. 111 Les phagocytes et le bacille du tétanos. — Pourquoi les bacilles tétaniques ou les spores sans toxine sont-ils incapables de se développer et de produire la maladie, lorsqu'ils sont introduits à l'état de pureté dans un tissu sain? 11 est facile de Tapprécier si l'on suit le sort de l'agent pa- thogène après qu'il a pénétré dans ce tissu. Le procédé de l'inoculation dans la chambre antérieure de l'œil des animaux sensibles à la maladie^ cobaye ou lapin, n'est pas le plus favorable à cette étude : du moins il ne nous a pas donné à cet égard les mêmes facilités que les autres méthodes de recherche; il fournit cependant des indications utiles. Après l'injection d'une petite quantité de spores privées de toxine par le lavage ou le chauffage à Go'\ il ne tarde pas à se produire un trouble marqué de l'humeur aqueuse ; un dépôt do leucocytes se forme à la partie déclive de la chambre antérieure. Eu préle- vant du liquide dans la cavité oculaire à des périodes variables après l'infection, on constate, dans la généralité des cas, que les microbes ont déjà disparu après 5 ou 6 heures ; les leuco- cytes sont abondants et quelques-uns renferment à leur inté- rieur une ou plusieurs spores colorables. Mais, en raison de la difficulté que l'on éprouve à vider la chambre antérieure de son contenu, il est malaisé de suivre avec rigueur toutes les phases du phénomène. Deux faits, toutefois, paraissent certains : d"une part, l'élimination des microbes dès les premières heures de leur pénétration ; d'autre part, la présence de spores dans le protoplasma des leucocytes, d'où l'on peut inférer le méca- nisme réel de la disparition de l'agent pathogène. Plus rigoureuses et plus significatives deviennent les consta- tations si on a recours, chez le lapin, au procédé des lamelles de Ziegler chargées de microbes sans toxine et introduites sous la peau de la région de l'aine. On peut encore, et non moins utile- ment, opérer sur le cobaye en plaçant, avec la plus rigoureuse C0>!T1UBUTI0N A L'ETUDE DU TETANOS. 35 asepsie, dans une poche du tissu conjonctif sous-cutané, un petit frai^ment d'ouate stérile, imprégné de bacilles sporulés sans toxine. Les lamelles de Ziegler examinées après ."> ou 6 heures ne montrent déjà presque plus de microbes libres, mais on y trouve en notable quantité des leucocytes contenant de 1 à 4 spores colorables. Presque toujours ces spores sont vivement teintées par la fuchsine de Ziehl; quelquefois elles sont pâles, réduites de volume comme si elles étaient déjà en partie détruites. Si l'examen des lamelles est retardé jusqu'à la 18'^ ou la 24'' heure, les leucocytes qui renferment des spores sont devenus très peu nombreux; peut-être ont-ils émigré ailleurs, peut-être ont-ils digéré les spores sur place. L'étude des petits fragments d'ouate imprégnés de spores sans toxine et introduits sous la peau du cobaye conduit à des résultats identiques. Sur les préparations faites avec l'ouate «pii a séjourné 1 heure l/2dans lalogeltesous-cutanée,lesleucocytes ne sont pas encore abondants, mais plusieurs contiennent de là 3 spores; beaucoup de microbes sont libres. Après 5, 4, et même 3 heures, on ne trouve plus de bacilles libres, les leucocytes sont devenus très nombreux et ils renferment des spores dont les unes sont fortement colorées, les autres pâles et de diamètre réduit. Les phagocytes englobent donc les bacilles et les spores qui ont été introduits sous la peau ou dans la chambre antérieure de Toeil. La lutte est précoce entre les microbes et les éléments cellulaires; elle s'établit dès les premiers instants de l'infection, etl'onesttenté de croire que, très rapidement aussi, les leucocytes détruisent l'envahisseur, car il est impossible d'en retrouver trace après 18 ou 20 heures: la teinte pâle et la réduction de volume que présentent parfois les spores ingérées autorise au moins à le penser. On ne saurait chercher ailleurs que dans le phénomène de la phagocytose l'interprétation exacte des faits où l'on a vu de grandes quantités de bacilles ou de spores dépourvus de toxine rester inertes et sans effet sur l'animal: les bacilles ne pullulent pas, les spores sont incapables^e germer parce que les uns et les autres sont immédiatement englobés par les leucocytes. L'orga- nisme, en effet, n'est pas un milieu de culture inerte ; il se défend , 36 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. et, dans les conditions indiquées, ia défense est tellement sûre et prompte que le microbe est mis hors d'état de nuire avec une surprenante rapidité. Si le fait de la phagocytose représente bien, dans la réalité, le système défensif d'un organisme sain menacépar les spores du bacille tétanique, une conséquence en découlera : toutes les influences qui pourront agir défavorablement sur les phagocytesi soit en les empêchant d'affluer au point contaminé, soit en paralysant leur activité, soit encore de toute autre manière, devront favoriser le développement des spores et, par suite, l'apparition du tétanos. C'est, en effet, ce qui paraît se produire dans les expériences où nous avons vu les spores sans toxine donner le tétanos aux animaux, grâce à l'intervention d'un agent chimique ou d'un microbe déterminé. Dans le cas de l'injection de l'acide lactique, on ne trouve au foyer de la lésion musculaire qu'un nombre infime, à peine appré- ciable de leucocytes ; en revanche les microbes y confluent, non pas sous la forme des bacilles en épingle qui ont été injectés, mais de bâtonnets réguliers, isolés, articulés ou filamenteux, représentant l'état du microbe lorsqu'il est jeune et en voie de développement. N'est-il pas présumable que l'acide lactique a exercé une action vivement répulsive sur les leucocytes, et que, grâce àTabsence de ces derniers, les spores ont pu germer à leur aise, comme dans un bouillon de culture? Tout autres sont les conditions réalisées par l'injection simultanée du microbacillus prodigiosus et des spores du bacille tétanique. Au point inoculé s'étale un exsudât membraneux épais, environné par une large zone d'hypérémie avec léger œdème. La pseudo membrane est uniquement formée de leuco- cytes pressés qui abondent également dans les régions œdéma- tiées. Sur toutes les préparations, entre les leucocytes, on trouve en abondance les bâtonnets du bacille tétanique en voie de multiplication. Ici donc, malgré un aftlux leucocytaire colossal, les spores n'ont pas été englobées, elles ont pu germer et pro- duire la maladie. Le fait n'a rien de contradictoire avec la notion établie plus haut concernant le rôle défensif dévolu aux phago- cytes. Des millions de inicrohaci II m^ prodigiosus ont été injectés; on n'en retrouve plus trace au point d'inoculation, sauf dans les leucocytes. N'y a-t-il pas lieu de croire que les phagocytes ont CONTRIBUTION A L'ETUDE DU TETANOS. 37 (l'abord et uniquement eni^lobé les cellules de cet agent banal, laissant aux spores du tétanos le temps de germer et aux ba- cilles issus de ces dernières le loisir de sécréter la toxine. Le leucocyte n'est pas guidé par un mobile conscient, mais par une véritable attraction d'ordre purement chimique ou physique; il va à ce qui l'attire le plus, et, dans le cas particulier, ce n'était vraisemblablement pas l'agent pathogène. Qu'il s'agisse de l'acide lactique ou du microbacillus prodi- giosus, le mécanisme de l'infection est au fond le même : l'acide lactique écarte les leucocytes et permet aux spores d'évoluer; le inicrobacillus prodiyiosus attire les leucocytes, mais absorbe toute leur activité, et, pendant ce temps, les spores dangereuses germent. Tous les faits expérimentaux ne se prêtent pas à une inter- prétation aussi facile. Par quel mécanisme ont agi les associa- tions microbiennes qui provoquaient le tétanos chez les animaux porteurs d'une plaie ouverte et préalablement infectée? Tantôt il y avait suppuration, mais réduite à des proportions insigni- fiantes; tantôt la plaie, presque oblitérée, laissait suinter un li- quide hématique extrêmement pauvre en cellules blanches. Evi- demment l'afflux leucocytaire capable de préserver l'animal avait été réduit ou empêché. Comment? On ne peut que constater le fait et en soupçonner la cause. Notons qu'il suffit de quelques spores qui germent pour sécréter la dose de toxine capable de donner la mort. C'est à peine si, dans les plaies ouvertes, on trouvait quelques bacilles tétaniques; dans l'exemple précédem- ment cité du cobaye qui avait succombé après une contusion de la cuisse, il a été impossible, par l'examen microscopique, de saisir le foyer de la culture des spores qui avaient provoqué le tétanos. Après avoir mis en relief le rôle hautement préservateur des phagocytes, il convient d'ajouter qu'il a cependant des limites. Efficace lorsqu'il s'agit de spores dégagées de toute toxine, il deviendra presque nul si les microbes ont pu déjà sécréter leur poison. Ce dernier, en effet, jouit de propriétés chimiotactiques dont mention doit être faite. Si l'on place sous la peau de l'oreille du lapin des tube§ capillaires contenant une culture chauffée à 60°, on voit que très rapidement leur extrémité ouverte est encombrée de feuco- 38 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. cytes; ceux-ci, après lo heures, ont formé un bouchon qui s'élève sur une hauteur de 1 millimètre à 4 millimètre 1/2. Des tubes semblables, mais remplis d'une culture non chauffée, sont introduits comparativement sous la peau de loreille du même animal; c'est à peine si, après 15 heures, la limpidité du liquide renfermé dans les tubes est troublée; les cellules blanches y sont presque rares, et Ton ne constate pas l'existence du bou- chon leucocytaire comme dans le cas précédent. La toxine n'attire donc pas les leucocytes, elle paraît même les repousser, tandis que les microbes, dégagés de leur poison, exercent sur eux une attraction très marquée. Le rôle préservateur des phagocytes sera donc plus ou moins facile, suivant que les cellules auront à agir sur des microbes accompagnés de leur toxine, ou sur des spores dégag-ées de toute trace do poison. L'expérience suivante semble l'indiquer. Une culture ne contenant que des spores est divisée en deux parties; l'une est chauffée pendant IS minutes à 63°, l'autre reste en l'état. Aveccesdeuxliquides,onemplit un certain nombre de tubes capillaires qui sont inséréssimultanémentsouslapeaude l'oreille de plusieurs lapins. A des périodes variables on retire un tube de chaque espèce, et on recueille exclusivement le liquide qui se trouve à son extrémité ouverte, c'est-à-dire celui qui contient le plus de leucocytes. Ce liquide est ensuite ensemencé en bouillon dans le but de savoir ce qu'il est advenu delà vitalité des spores ainsi maintenues au contact des cellules blanches. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau suivant. Culture non chauffée. Durée du sc'jour du tube Résultai de sous la ])C'au. l'ensemencement. :24 heures 4- 36 — + 40 — -I- 48 — -I- 4 jours -|- 7 - + Culture chauffée. Durée du séjour du tube Résultat de sous la peau. l'ensemencement 5 heure*. -f 8 - + 9 - -f 13 - + -15 — — 17 — — 3 jours. — Après 13 heures, on ne trouve plus de spores revivifiables dans les tubes contenant la culture chauffée (fait qui concorde avec les données précédentes), tandis que ces spores sont encore bien vivantes après 7 jours, lorsqu'elles sont exposées, munies CONTRIBUTION A LETUDE DU TÉTANOS 39 (le leur toxine, à ractiou des cellules blanches. Dans le premier cas, l'aftlux: leucocytaire a fUé abondant et la phagocytose rapide; dans le second, la toxine, en verlu de ses propriétés chimiotac- tiques, a réduit à des proportions très minimes la migration des leucocytes, paralysé peul-êLre leur action, et protégé ainsi les spores contre l'englobement. Si l'on applique ces résultats aux circonstances de l'infection naturelle, il en ressort que les pha- gocytes pourront agir utilement lorsque les spores n'auront pas encore germé et produit leur poison, mais que leur intervention sera difficile ou nulle dès que les microbes auront déjà commencé à élaborer la toxine. RECDERCnES SUR LA FOKTIOI DE LA RATE DANS LES MALADIES liNFECTIEUSES (2e MÉMOIRE.) Par m. J. BARDACH. a *Wv ^ V , * ^ Dans un premier article ' sur le rôle de la rate dans les maladies infectieuses, j'ai cherché à prouver (par des expé- riences sur dâs chiens) que la fonction de cet organe était sur- tout phagocytaire ; c'est la rate qui protège le sang contre l'inva- sion des microbes et qui produit les phagocytes de l'organisme. Son caractère phagocytaire est en parfait accord avec les don- nées scientifiques sur son embryologie, son histologie, son anatomie pathologique, ainsi qu'avec l'expérience. M. Kourloff, dans des expériences sur des lapins dératés, est arrivé à des conclusions différentes, mais qui ne peuvent être acceptées, car une partie de ses expériences a été faite dans des conditions où le rôle de la rate ne pouvait être mis en évi- dence : M. Kourloff injectait dans le sang des microbes, patho- gènes aussi pour les lapins non dératés. Dans ces conditions, les lapins normaux succombaient tout aussi bien que les déra- tés; parfois avant, parfois après. Mais la durée de la survie ne peut servir de critérium, car, inoculés par un même microbe pathogène, les lapins normaux, et en général des animaux de même espèce pris dans des conditions de vie aussi semblables que possible, meurent à des termes différents. La durée de la survie dépend d'une foule de propriétés individuelles. En ce qui concerne la seconde partie des expériences de M. Kourloff, celles qui ont été faites avec des microbes peu ou point pathogènes, il faut en exclure 5, dans lesquelles les té- 1. Ces Annales, t. III, p. 577. LA l{ATK DANS LES MALADIES INFECTIEUSES. 41 moins succombèrent aussi bien que les lapins dératés. Quant aux (î autres expériences, leurs résultats ne peuvent donner lieu à des conclusions quelconques, parce que les microbes étaient inoculés sous la peau, de sorte que la recherche de l'in- fluence de la rate était compliquée par l'introduction des leuco- cytes et des phagocytes du tissu conjonctif, qui peuvent entrer en action, mèaie chez des animaux aussi sensibles au charbon que les lapins : ainsi, dans les inoculations sous-cutanées, on trouve chez eux, quoique rarement, des bactéridies englobées dans les cellules; chez les animaux réfractaires, comme le chien, la phagocytose est plus prononcée, à peu près cinq à six fois plus que chez le lapin. Il est évident que pour juger du rôle de la rate, il est indispensable d'éviter tous les facteurs qui peuvent obscurcir ses fonctions, et c'est justement ce qui n'a pas été fait dans le travail de M. Kourlolî. Des travaux récenls tendent à expliquer l'immunité natu- relle et acquise, aussi bien que la guérison, par les propriétés bactéricides du plasma sanguin et de ses dérivés, lymphe, etc. Ces travaux semblent être en contradiction avec le rôlephagocytaire de la rate, comme organe représentant une agglomération d'élé- ments cellulaires. Ainsi M. Fodor croit que les microbes (bactéri- dies) parvenus dans le foie, la rate et les autres organes, y sont moins exposés àl'iniluence bactéricide que dans le sang de la circulation, si bien qu'ils peuvent y pulluler et pénétrer dans le sang-. Là, ils" sont détruits; mais le foie et la rate, qui sont pour eux des milieux très favorables, continuent à en fournir de nouvelles tribus, qui finissent par vaincre la résistance du sang-, l'envahissent et amènent la mort de l'organisme. A ce point de vue, la rate serait plutôt un org-ane favorisant le développement de la maladie. Mais une analyse plus approfondie des données acquises à ce sujet démontre l'inexactitude du point de vue de M. Fodor. Ainsi on a souvent vu la propriété bactéricide du sang- de telle ou telle espèce animale être sans aucun rapport avec sa sensibilité pour telle ou telle maladie : la propriété bactéricide du sang du lapin est très forte en comparaison de celle du chien qui, lui, contrairement au lapin, possède une inimunité naturelle pour le charbon, et même ^st très peu sensible aux inoculations. Contrairement aux suppositions de M. Fodor, le pouvoir bactéricide du sang nouvellement épanché est beaucoup plusgrandî 42 ANNALES DE- L'INSTITUT PASTEUR. que celui du sang- de la circulation, comme l'a démontré 31. Lu- barschsur des chats etdes lapins. Ainsi, dans unedes expériences, 1 centimètre cube du sang- de lapin avait tué 2 millions et demi de bactéridies, tandis que tout le sang- dans l'organisme dulapin ne pouvait détruire ni même arrêter le développement de 16,450 bactéridies. Il est clair que le pouvoir bactéricide du sang, qui augmente tant et si rapidement en dehors de l'organisme, est dû à quelque procès post-mortel s'opérant dans les éléments sanguins, mis dans des conditions différentes de leur vie normale. M. Lubarsch essaie d'expliquer la diiïérence de l'action iutra et extra-vascu- laire du sang par l'hypothèse suivante: il admet que le sang- delà circulation contient un facteur, favorable au développement des bactéridies, et il trouve ce facteur dans le procès constant de destruction des globules sanguinsdans la rate, le foie, et la moelle des os, procès d'où résulte un milieu nutritif pour les bactéridies, qui surmontent ainsi le pouvoir bactéricide du sang-. L'inexactitude de cette opinion est évidente, car les obser- vations directes sur le sort des microbes introduits dans le sans, et englobés par les micro et macrophages de la rate, lui sont complètement contradictoires. Comment aussi concilier avec ce point de vue l'absence si remarquable de spirilles dans la rate pendant la fièvre récur- rente, tandis qu'elles pullulent dans le sang pendant la maladie, et, par contre, leur présence dans la rate et leur disparition dans le sang justement pendant la guérison, l'apyrexie? Gom- ment concilier aussi les expériences faites par moi, et où, après l'inoculation du charbon, il succomba 15 chiens sur 25 dé ratés et seulement 5 sur 25 non dératés? Il est évident que la cause de l'immunité naturelle et ac- quise, et de la g-uérison, est due à l'influence active des éléments cellulaires et des organes spéciaux; car j'ai démontré dans mon premier travail qu'on a toujours un développement abondant en ensemençant les bactéridies sur la rate fraîche d'un chien nor- mal, et d'un chien ayant résisté à une inoculation charbonneuse. Il est vrai que M, Buchner a objecté qu'en flambant la sur- face de la rate, j'élevais la température de ses tissus, et que j'éliminais par là le facteur bactéricide, qui disparaît après un chauffage à 55° pendant un quart d'heure. Mais il est évident LA HATE DANS LES MALADIES INFECTIEUSES. 43 qiio le flambage superficiel, rapide, d'un corps si mauvais conduc- teur que Test la pulpe de la rate, ne peut élever la température du tissu intérieur à 55o. La preuve en est que les tissus sous- jacents à Tescarre restent complètement normaux. Du reste, l'expérience a prononcé. En introduisant un thermomètre très sensible dans la pulpe de la rate nouvellement extraite et en flambant la surface immédiatement au-dessus de lajboule, on parvient à élever la température tout au plus de 2 degrés. Températuro avant le flambage 36°,7 36°. 2 33», — apn's 36",8 37M 34°,7 Ainsi il est clair que c'est à la cellule vivante qu'est due l'im- munité naturelle et acquise. Il était très important d'observer à ce point de vue un microbe, qui, inoculé dans le sang- d'un animal normal, est non seulement inoiïensif pour lui, mais encore indispensable comme facteur de son immunisation; je veux parler du premier vaccin charbonneux. On sait que MM. Roux et Chamberland ont vacciné des lapins en leur inoculant de grandes quantités du premier vaccin directement dans le sang, et puis O'c,2o du deuxième vaccin sous la peau. Dans l'injection intrn-veineuse du premier vaccin char- bonneux, les bactéridies disparaissent très vite du sang-, et déjà, après quelques heures, on les retrouve dans les organes, dans les cellules de la pulpe de la rate. Comme le vaccin disparaît du sang dans un temps très court, et ne se retrouve que dans les or- ganes, et comme l'inoculation du premier vaccin a pour résultat l'immunité contre le second, on peut admettre que cette vacci- nation s'opère dans les organes dont les éléments cellulaires s'accoutument à digérer les bactéridies du premier vaccin et fournissent aux tissus de l'organisme des cellules déjà adaptées. Pour distinguer le rôle de la rate de celui des autres organes dans le procès de la vaccination, j'ai fait une série d'expériences parallèles sur des lapins normaux et dératés. En général, les lapins supportent facilement l'opération : ils se rétablissent bientôt, regagnent leur poids primitif, mangent et boivent normalement. Pour mes expériences, je me servais habituellement de lapins qui avaient subi l'opération depuis un à trois mois. Je prenais pour témoins des lapins de même poids. J'injectais 40 centimètres cubes du premier vaccin dans la veine de l'oreille, opération que les lapins supportent très bien. J'ai 4i ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. fait en tout 35 expériences, tous les lapins ?îo/'ma?/j" supportèrent très bien la vaccination ; leur température subissait des oscilla- tions dans les limites normales; les accès de lièvre vaccinale n'étaient' que de courte durée pendant le 2^ 3^ jour. Quant aux lapins dératés, il en succomba 26 sur 3o. On ne peut attribuer ce résultat frappant qu'à l'absence de la rate. L'influence de cette absence se faisait sentir déjà le 2^, Séjour après l'inoculation : tandis que les lapins normaux man- geaient et buvaient bien, les lapins dératés étaient sans appétit, inertes; leur température s'élevait jusqu'à 40 — 41°; elle restait élevée pendant 2, 3 jours, après quoi les lapins succombaient. Quelquefois le lapin dératé paraissait rester en bonne santé pendant 6 à 7 jours après l'inoculation du premier vaccin, et en- suite il succombait tout à coup. A l'autopsie, on trouvait toujours dans le sang et les organes des bactéridies caractéristiques du charbon. Des ensemencements étaient toujours faits avec le sang et les organes, et donnaient des résultats positifs. Les cultures se développaient faiblement sur la gélatine et abondamment dans le bouillon et sur la gélose. Comme les résultats de ces nombreuses expériences ont été constants, nous avons le droit de conclure que la mortalité par le premier vaccin est due à l'absence de la rate, c'est-à-dire que parmi les organes contribuant à l'efficacité de la vaccination, c'est la rate qui joue le rôle principal. La preuve qu'elle n'est pas le seul organe contribuant à l'acquisition de l'immunité est fournie par ce fait qu'il y a des cas {9 sur 35) de résistance au pre- mier vaccin parmi les lapins dératés. Ces expériences sur les lapins servent d'appuis à celles que j'ai faites sur les chiens. Voici en résumé les 7 expériences que j'ai faites : Lapins norni,",ux. Lapins dératés. Inoculés. Mortir Inoculés. ^MortsT 2 octobre . . 5 5 10 — 5 () ;> 5 15 — 5 ,0. 5 3 29 — 5 5 i 15 novembre . 5 G 5 i 1^'' déceml)re . 5 G 5 . 3 16 — 5 G 5 2 Total . ,. 35 téiu. Mortal. nulle. i 35,hip..dér. '26 morts. LA RATE DANS LES MALADIES L\FEGTIEUSES. 45 E.XPKKIENCK DU 15 OGTOUIîE LAPINS DÉRATÉS 15 16 17 18 19 20 POIDS 38.6 s 39.1 m 39.9 S 39.5 m 40.1 s 40.2 m 40.8 40.8 m 40.0 S 39.3 m + j; I —980»' 11 —950 38.8 39.9 40.0 40.9 39.6 39.5 39.1 39.9 39.5 39.6 39.2 39.4 111-945 38.4 39.2 39.9 41.0 40.4 40.5 40.8 40.8 + IV —915 39.2 39.7 39.7 40.4 40.1 40.9 39.6 37.4 36.5 + V —905 39.0 39.2 39.8 39.9 40.0 39.1 39.0 39.6 39.5 39.7 39.8 35.5 TÉMOINS 1 I —945 38.7 39.1 30.5 40.0 39.2 39.4 39.5 39.6 39.1 39.2 39.1 39.4 Il — 9I() 39.1 39.4 39.6 39.9 40.0 39.1 39.4 39.2 39.3 39.4 39.1 39.4 111 — 970 38.9 38.9 39.2 39.9 39.1 39.5 39.0 39.4 39.1 39.1 38.7 39.1 IV — 928 38.8 39.2 39.9 39.1 39.1 39.2 39.4 39.5 39.1 39.4 39.0 39.2 V —915 39.0 39.1 40.2 39.1 39.1 39.9 39.2 39.5 39.1 39.4 39.1 39.5 I. Mort dans la nuit du 20; foie et mésentère h3^péroiniés ; pas d'oedème ; bactéridies dans le sang elles organes, les ensemencements donnèrent des résultats positifs. III. Mort dans lanuit du 19; forte hypèrémie des poumons et du foie, bac- téridies dans le sang et les organes: ensemencements pnsitifs. IV. Mort le 19. Hypèrémie prononcée du foie; bactéridies dans le sang et les organes. Les ensemencements donnèrent des résultats pnsitifs. Les lapins II et V survécurent. La température du II s'éleva de plus de 2 degrés. Le 16, il était très faible, mais bientôt il se rétablit complètement. Le Ve réagit par une fièvie légère, qui peut être observée chez les lapins normaux. La température s'était élevée de 39», 2 à 39°, 39",5, 4Q",0 et était restée normale ensuite. EXPÉRIENCE DU 29 OCTOBRE. L.\PINS DÉRATÉS 29 30 31 1 2 3 POIDS Ml 38.7 S 39.6 m 39.9 s 40.1 m 39.8 s 40.2 m 40.5 s m s 38.5 m 37.6 s I — 950?'- 40.8 39.7 + 11 — 965 38.8 38.9 40.2 41 . 1 39.6 39.4 39.2 39.5 39.1 39.9 39.2 39.5 m — 9(j7 38.9 39.2 39.1 39.9 41.2 41.4 41.6 + IV — 915 39.1 39.7 39.9 40.1 40.2 40.8 40.1 40.4 40.2 39.2 36.8 + V — 980 39.2 39.5 40.1 40.9 40.4 41.0 39.6 38.7 + TÉMOINS 1 1 — 1015 39.2 39.4 39.3 41.2 38.7 39.2 39.1 39.4 39.2 39.5 39.1 39.5 11 — 970 39.1 39.5 39.8 40.6 39.2 39.4 39.1 39.7 39.7 39.3 39.6 39.7 m — 940 39.1 39.4 39.0 39.3 39.1 39.3 39.2 39.3 39.5 38.5 39.0 39.1 IV -1010 38.9 39.2 39.2 39.9 \9.\ 38.7 38.8 38.9 38.5 39.2 38.6 38.5 V - 918 38.8 38.9 39.7 40.1 39.6 39.9 39.1 39.5 39.1 39.6 39.1 39.8 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. l. Mort le 3. Quelques nodosités contenant des psorosperniies dans le foie, qui est agrandi. Lobe inférieur du poumon droit hépatisé; reins et poumons hypéréraiés; le sang et les organes contiennent des bactéridies. Lesensemence.ments donnèrent des n^'sultats positifs. III. Mort le tc"-. ifner fmie hj/pér/'inie do tous les organes parenchymateux; péricardite séreuse-. Des bactéridies dans les organes et le sang. Les ense- mencements donnèrent des résultats positifs. IV. Mort le 3. Le foie et les reins hypéréniiés; bactéridies dans le sang et les organes. Les ensemencements donnèrent des résultats positifs. V. Mort la nuit du 2. Psorospermies dans le foie; une pleuro-pneu- raonie droite. Bactéridies dans le sang et les organes. Les ensemencements donnèrent des cultures. H. Réagit par une courte élévation de température de SS'jS à 400,2, -41°, 1 et s'estpromptemont rétabli ensuite. EXPERIENCE DU 15 NOVEMBRE. LAPINS DÉRATÉS 15 16 17 18 19 20 POIDS . '^' 1 m .39.2 .39.5 39.8 .39.8 40.5 S 41.1 m 40.8 s 41.0 m 40.7 s m S I — I055sr 37.6 + 11 —1018 38.5 38.9 38.3 41.2 40.0 40.7 40.2 40.5 39.2 39.9 40.2 38.7 III— 990 38.9 39.2 39.9 40.5 40.4 39.(5 39.2 39.4 39.2 39.5 39.7 39.8 IV— 940 39.0 39.2 39.9 40.4 41.2 41.4 40.6 40.8 + V — 950 38.5 38.9140.1 40.0 40.1 40.4 40.0 + TÉMOINS I — 950 39.1 39.4 .39.9 40.0 38.5 39.2 39.1 39.4 39.2 39.6 39.0 39.1 II — 91 iO 39 39 . 2 :i9.9 40.2 39.0 39.2 39.2 39.5 39.1 39.4 39.0 39.5 III— 940 38.5 38.8 38.8 39.2 38.8 38.5 38.1 38.0 39.0 39.2 38.5 38.7 IV— 91. ^i 38. (; 39 . 2 39.1 39 . S 39.2 39.7 39.2 39.2 38.7 39.5 38.9 39.7 V — 9i>3 38.9 39.3 40.8 40.0 38.2 38.8 38.5 39.0 39.2 39.7 39.1 39.4 I. Mort dans la nuit du "10. Phénomènes d'hypérémie générale. Bactéri- dies dans les organes et le sang. Ensemencements positifs des cultures. IL Mort dans la nuit du 21. Le foie contient beaucoup de psorospermies; Bactéridies dans les organes ot le sang en petite quantité. Ensemencements positifs. IV. Mort dans la nuit du 19. Beaucoup de bactéridies dans le sang et les organes. Ensemencements positifs. V. Foie très agrandi; pouuions fortement hypérémiés. Bactéridies dans le sang et les organes. Ensemencements positifs. III. Fièvre pendant les deux premiers jours: absence d'appétit; rétablisse- ment complet. LA UATK DANS LES MALADIES INFECTIEUSES. 47 EXPERIENCE DU I"'- DECEMBRE. I.A1>IN>< KKUAI'KS 1 2 3 4 5 6 POIDS .— — V- — . — ^--. — . —~^ ^— ^ m 39.0 s 39. -> m 39.9 40.0 III 40.2 S 40.9 m 41.0 S 41.5 ■Il 40.8 s 40.2 m + S I — 98(>'^ Il -900 38. (i 38 . 9 39.2 39.3 39.. 5 39.8 41.2 41.7 40.7 40.4 40.1 39.6 111 — 910 3!).l 3<) . 3 3lt.5 39.8 39.3 41.2 3!». 2 39.5 39.0 39.5 39.1 39.4 lV-91o 38.8 39. 1> 38. «t iO . 1 40.4 40.7 i 1 . 2 + V —910 39. -> 39.7 30.9 40. 5 40.2 40.8 40.9 41.1 40.4 40.8 40.0 40.2 TÉMOINS 1 I —905 38.8 39.2 40.9 39.3 39.1 39.8 39.2 39.5 39.6 39.8 .39.2 39.5 Il — 9i0 39.1 39. -4 39.(5 .39.4 39.1 39.5 38.7 .39.2 39.1 39.6 39.1 39.8 111 - 9io 39.0 39.. 5 41.0 39.7 39.0 .39.0 39.5 39.0 39.0 39.2 38.9 39.7 IV — 965 38.7 39.2 40.1 39.2 39.1 .39.4 39.4 39.7 38.7 39.6 38.6 39.5 V -915 38.5 39.1 3y.9 39.0 38.7 39.2 39.0 39.2 38.9 39.2 38.9 39.7 I. Mort dans la nuit du fi. Le fuie agrandi est hypérémié ainsi que les poumons. Bactéridins dans les organes ctle sany. Ensemencements positifs. IV. Mort le 4. Forte liypérémie de tous les organes internes. Baciéridies dans le sang et les organes. Ensemencements positifs. V. Mort le 7. Poumons fortement hjpérémiés; bactéridies dans les organes et le sang. Ensemenccmenls positifs. Le II a eu, le 3- jour après l'inoculation, une forte fièvre qui dura pen- dant trois jours, après quoi il se rétablit complètement. Le III ne reagit à l'inoculation des vaccins que par une courte mais forte " •"" '^" température pendant le 2û jour. Il se rétablit complè- élévation de lenienl EXPÉRIENCE DU 2 OCTOBRE. LAPINS I) KRATKS 2 3 4 5 6 7 POIDS ^— ._-^-.^~ -^..^-^-— , 1 . «^».^_^ — - — -. ■ , — m 39.1 S 39.3 m 40.0 s m s m s m s m s I — 940^^ 40.5 41.0 41.0 37.2 + II — 922 ,38.9 39.2 39.1 39.5 40.0 39.9 39.8 40.2 40.4 40.8 40.1 39.9 111—1018 38.7 39.5 39.7 40.2 39.8 40.7 41.4 + IV— 925 39.4 39.2 .39.0 39.9 41.2 41.8 41.4 41.7 36.9 36.2 + V — 943 39.0 39.1 39.3 39.9 40.8 37.6 38.9 38.7 + TÉMOINS II I — 952 39.2 39.8 40.2 40.8 39.2 .39.5 38.9 39.1 38.8 .39.2 39.4 39:6 11 —1016 38.7 38.9 41.0 39.2 38.8 39.. 1 39.2 39.4 .39.5 39.3 .39.7 39.8 111— 948 39.1 39.4 .39.2 39.5 .39.1 39.1 .39.2 39.4 .38.8 ,39.1 39.1 39.2 IV- 913 38.9 39.5 40.3 40.9 38.5 38.9 39.1 39.5 39.1 39.4 39.2 39.4 V — 975 38.8 39.7 39.9 41.0 38.8 39.3 39.2 39.4 .39.1 39.3 39.2 39.4 48 ANNALES DE, L'INSTITUT PASTEUR. I. Mort le 5. Bactéridies sur les préparations du foie, de la rate, des poumons, des reins et du sang. Lî^s ensemencemenis sur gélose et dans le bouillon donnèrent tous des cultures. Le foie hypérémié, ainsi que les pouT nions; pas d'œdèmes. II. Mort le 8. Foie hypérémié, ainsi que les poumons, pas d'œdèmes. Des bactéridies sur les préparations colorées par le bleu de méthyle. Ensemen- cements positifs. III. Mort le 5. Des foyers peu nombreux de psorospermies dans le foie, qui est agrandi et hypérémié; un e.xsudat séreux purulent dans la cavité pleurale. Une petite quantité de bactéridies dans l'exsudat. Des bactéridies sur les préparations faites avec les organes et le sang. Les ensemencements donnèrent des cultures. . IV. Mort le 7. Foie, reins et poumons hypérémiés; les glandes mésenté- riques agrandies. Bactéridies dans les organes et le sang. Ensemencements positifs donnant des cultures. V. Mort dans la nuit du 0. Le foie contient quelques foyers de psoros- permies; les poumons fortement hypérémiés. Bactéridies sur les prépara- tions des organes et du sang. Ensemencements positifs. Les témoins man- gent et boivent; ils sont complètement normaux. EXPERIENCE DU 10 OCTOBRE LAPINS DÉRATÉS 10 11 12 13 14 15 POIDS ^ ^ . ^^ — . . , — m 39.1 s 39.1 m 40.8 s 40.9 m 40.4 s 40.*^ m 39.8 s 37.2 + S m s I —950?^ 11 -940 38.5 39.4 40.1 40.0 40.1 40.5 39.5 40.8 40.1 40.2 + 111 — 955 39.6 39.0 39.9 39.7 39. a 41.0 40.8 40.7 40.2 39.1 + IV -980 39.1 39.4 39.9 40.1 39.5 39.1 39.3 39.8 37.1 + V — 9i5 38.5 39.3 39.9 40.1 40.5 40.6 41.0 37.6 36.9 36.5 36.5 + TÉMOINS I —910 39.2 .39.4 40.6 39.6 .39.9 39.9 39.5 39.8 .39.6 39.1 39.2 39.711 11 —950 39.0 39.5 39.2 40.0 38.7 39.2 39.1 39.4 39.7 39.6 39.4 39.5 111-915 38.5 39.9 40.3 39.2 38.6 39.5 37.5 39.1 38.5 39.2 39.1 39.4 IV— 945 39.1 39.1 40.0 39.9 38.5 39.6 38.5 39.1 39.2 39.5 39.4 39.1 V —920 39.0 40.2 38..^ 39.6 39.1 39.2 38.8 39.5 39.6 39.7 39.5 38.9 I. Mort dans la nuit du 14. Organes parenchymateux agrandis et hypé- rémiés; ils contiennent, ainsi que le sang, des bactéridies. Ensemencements positifs. II. Mort dans la nuit du IS. Pas d'œdèmes; bactéridies dans les organes. Ensemencements positifs. III. Mort dans la nuit du lo. Des psorospermies dans le foie; des bactéri- L.\ HATE DANS LES MALADIES INFECTIEUSES. 49 dies dans les organes et le sang-. Les ensemencements donnent des cul- tures. IV. Mort le 14. Très épuisé; une diarrhée pendant le M et 14; les organes tn'-s anémiques; bactéridies dans le , foie et le .sang. Ensemencements po- sitifs. V. Foie, reins et glandes mésenteriques très hypérémiés; bactéridies dans les organes et le sang. Ensemencements positifs. EXPÉRIENCE DU 16 DECEMBRE 16 17 18 19 20 21 POIDS ^-.^ • ^- — . — - — ^-— ~-— — — ^--^ — , «^„^^..— ^ 38.5 S 39.6 ni 40.1 s m s 40.5 m 40.1 S m S m s 1 — 940-"' 40.4 40.2 40.8 40.1 40.5 40.4 40.5 II - 1015 39.6 39.9 39.4 41.5 40.0 41.0 40.5 + ni — 955 38.7 39.2 39.9 40.5 39.8 40.5 39.2 39.5 39.1 39.8 39.6 39.7 IV- 915 38.9 39.1 39.2 40.2 39.1 39.0 38.5 39.0 38.2 39.5 38.5 39.0 V — 9-20 39.0 39.4 40.5 40.0 39.1 39.3 39.0 39.6 38.7 39.2 38.8 39.5 TÉMOINS 1 — 950 38.8 39.5 40.3 39.7 38.7 39.2 38.5 39.6 38.5 39.3 39.1 39.2 Il — 960 39.1 39.8 40.2 39.1 39.3 39.5 39.6 39.5 39.0 39.1 38.7 39.5 m — 915 39.0 39.5 39.1 39.5 39.1 39.5 39.4 39.7 39.1 39.5 39.6 39.7 IV — 9i>0 38.7 39.1 40.3 40.1 38.8 38.5 38.6 39.2 38.7 39.5 39.0 39.2 \ — 945 38.6 39.1 38.5 39.5 39.1 39.5 39.2 39.5 39.4 39.6 39.1 39.5 I. Mort le 6* jour avec des phénomènes d'hypérémie prononcée des pou- mons et du foie. Des bactéridies dans les organes et le sang. Ensemence- ments positifs. II. Mort le 3* jour avec des phénomènes d'hypérémie générale des or- ganes ; pas d'œdèmes; des bactéridias dans le sang et les organes. Les ensemencements donnèrent des cultures. III. Fièvre le second et le troisième jour après l'inoculation; puis rétablis- sement complet. IV. L'élévation de température ne fut observée qu'une seule fois le second jour; une guérison complète suivit. V. Fi èvre second jour après l'inoculation, suivie d'une guérison com- plète. REVUES ET ANALYSES SUR LA STÉRILISATION DU LAIT REVUE CRITIQUE EsçHERiCH. Sur la stérilisation du lait, avec présentation d'appareils fondés sur le principe de Soxhlet. Munch. med. Wochenschr., 1889, •46-48. — E.mmaStrub. Sur la stérilisation du lait. Centralbl. f. Bact., 1890, t. YII, n"^ 21, 22, 23. — A. Lazarus. Les moyens usuels de conservation du lait. Zeitschr. f. Hyg., t. Mil, p. 207, 1890. — H. BiTTER. Recherches sur la pasteurisation du lait. Id., p. 240. — Heidenhain. Sur la stérilisation du lail par l'eau oxygénée. Cen- tralbl. f. Bact., t. VIII, n° 16, 1890. — Hesse. Sur la stérilisation du lait pour les enfants. Zeitschr. f. Hijij., t. IX, p. 360, 1890. — SoNNENBERGER. Origine et extension des maladies par le lait conta- miné. Deustsche med. Wochenschr., n°^ 48 et 49, 1890. L'une des découvertes les plus profitables de la bactériologie moderne a été celle du rôle du lait comme agent de transport de certaines maladies contagieuses, (^est aussi une de celles qui ont le plus de peine à se faire une place dans les esprits, et à entrer dans la conscience publique. On consent à laisser accuser l'eau, à laquelle l'homme reste toujours sourdement hostile, et qui a été honnie par tant de poètes biberonnants. Mais le nom de lait réveille dans l'esprit tant d'idées souriantes et de clichés louangeurs qu'on accepte avec peine l'idée que ce liquide devienne parfois dangereux. Il l'est pourtant souvent, soit que, provenantd'une vachesaine, il ait recueilli au passage et transporté avec lui dans Testomac des nourris- sons les causes des affections intestinales des nouveau-nés, soit qu'il provienne d'une vache malade et lui ait emprunté, par exemple, des germesde tuberculose. On m'a accusé d'avoir exagéré ce dernierdanger, et onadit que le nombre des vaches tuberculeuses est beaucoup moins grand que je ne l'ai prétendu. Plus je vais, au contraire, et plus je m'informe, plus je crois que je suis resté au-dessous de la réalité. Sur la totalité des animaux tués dans les abattoir?, il y a Berlin 4, o7 "/o, REVUES ET ANALYSES. 51 à Munich 2,44 "/o, ùAugstourg 2,24 °/(,, à .Mulhouse 3,4 "/(,, d'animaux tuberculeux, et si on songe que, de ces bêles immolées, les vaches sont en général les plus vieilles et celles qui ont été le plus exposées à la tuberculose, on conclura qu'il faudrait sensiblement élever les chitrres ci-dessus pour avoir les proportions des vaches tuberculeuses. Dans les abattoirs de la haute Silésie, oii on a fait le détail, on trouve, en efl'et, atteints de tuberculose, 0, 13 7o des veaux, 1 "/(, des taureaux, 1, 87 7o du jeune bétail, 7, 31 "/o des bœufs, 9, 54 "/o. des vaches, et comme on ne conduit dans les abattoirs que les animaux qui n'ont aucun signe extérieur de tuberculose, il est facile de conclure que le chitfre de 10 «/o» tiuquel je m'étais arrêté après enquête, est plutôt au-dessous qu'au-dessus de la réalité. Il restera, il est vrai, la ressource de dire que ce chiffre s'applique aux pays étrangers, non à la France, mais il faudra d'abord démontrer que nous y regardons d'aussi près qu'eux, et ce ne sera pas facile. J'ai la conviction qu'une enquête sur l'extension de la tuberculose, si elle était bien faite, donnerait des résultats navrants. Combien il y a de paysans et de fermiers qui ne s'inquiètent pas de la maladie des glandes chez leurs animaux, ignorant que c'est de la tuberculose! M. Sonnenberger affirme connaître, dans son pays, des régions dans lesquelles il y a 40 à 60 "/o de tuberculeux dans les élables. Il y a une autre maladie de la vache dont le transport par le lait, sans être aussi funeste que celui de la tuberculose, ne laisse pas que d"être quelquefois dangereux, c'est la fièvre aphteuse ou cocotte. Il y a une mortalité d'environ 50 °/o chez les veaux nourris avec un pareil lait. Les hommes, et surtout les enfants qui le consomment sans l'avoir fait bouillir souffrent de fièvre, d'insomnie, de vomissements, de coliques, de rougeurs et d'aphtes sur la muqueuse de la bouche et du nez. Demme a cité un grand nombre de cas pareils, et dans un cas de stomatite aphteuse grave qui avait entraîné la mort d'un enfant, il a relevé à l'autopsie l'agrandissement de la rate, une dégénérescence du foie et des reins, l'inflammation des follicules de l'intestin. Nous pourrions multiplier ces exemples, mais ceux-là suffisent pour donner une idée des dangers auxquels expose l'usage du lait consommé à l'état cru, alors même que Ton est à la campagne, qu'on le voit traire sous ses yeux, et qu'on est, ou plutôt qu'on croit être sûr de la bonne santé de la vache qui le fournit. Quand on est obligé de se contenter du lait vendu sur le marché, il y a un danger de plus à courir, c'est que le lait ait ramassé en route, au milieu de ses multiples transvasements dans des vases d'une propreté toujours douteuse, les germes sans doute banaux de ces maladies du canal digestif qui atteignent quelquefois les adultes, mais sont surtout fréquentes chez les enfants nourris au biberon. L'éliologle 52 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. de ces affections a quelque chose d'étrange et d'inexplicable. L'expé- rience a appris qu'elles accompagnaient l'emploi de lait conservé trop longtemps avant d'être consommé, et ayant commencé a surir. Elles n'apparaissent pas ou sont au moins très rares quand on se dserte lait bouilli, elles disparaissent même peu à peu, et quelquefois rapide- ment, sons l'influence de ce lait. Or, nous allons voir que le lait bouilli n'est pas privé de germes. En serait-il privé qu'il en rencontrerait sûrement de nouveaux dans la bouche, l'estomac ou l'intestin de l'enfant. Dès lors comment se fait-il que ces germes, qu'il puise dès son entrée, et qui l'accompagnent tout le long du canal intestinal, n'aient aucune qualité nocive, tandis que ceux qu'il a pu rencontrer à l'exté- rieur sur les parois des vases de transport, soient quelquefois si dangereux? Voilà une question à laquelle nous ne pouvons encore donner de réponse, mais que nous retrouverons tout à l'heure. Quoiqu'il en soit, à côté du péril des germes de maladie empruntés à la vache, il faut placer celui des germes d'origine banale empruntés au monde extérieur. Ce sont ces derniers qui ont le plus préoccupé les producteurs de laitet les commerçants, non pas, ai-je besoin de le dire, à cause du danger, longtemps ignoré, qu'ils faisaient courir au con- sommateur, mais parce qu'ils menaçaient la conservation du lait lui- même, et, pour assurer cette conservation, surtout au moment des chaleurs, on a imaginé diverses pratiques que M. Lazarus a eu l'idée d'étudier au point de vue bactériologique. Voici, par exemple, l'addition de carbonate ou de bicarbonate de soude. Quelle influence a-t-elle sur la multiplication des microbes qu'on rencontre le plus ordinairement dans les laits, et, si elle retarde le moment si redouté de la coagulation, parquet mécanisme y parvient elle? M. Lazarus a même poussé son enquête plus loin, et s'est demandé quelle était l'action -des divers antiseptiques sur l'évolution de microbes pathogènes éventuellement présents dans le laitt II a choisi pour cette étude les bactéries du choléra asiatique, du typhus abdominal, le bacille de Finkler-Prior, le bacillus neapolitanus d'Emmerich, et enfin le bacille décrit par Ribbert dans la diphtérie intestinale des lapins. Enfin il a poussé la conscience jusqu'à étudier comparativement le sort de ces bactéries pathogènes dans du lait stérilisé et dans du lait non stérilisé. Dans cet ordre d'idées, il a trouvé qu'elles croissaient mieux dans le premier que dans le second, où elles étaient d'ordinaire tuées par la concurrence vitale des espèces banales. Mais on ne gagne rien à mélanger tant d'influences, et nous nous contenterons de signaler les résultats obtenus avec le lait stérilisé, artificiellement infecté avec des espèces pathogènes, et soumis ou non à l'action des carbonates de soude, du borax ou de divers moyens de stérilisation. REVUES ET ANALYSES. 53 Les expériences se faisaient en mettant côte à côte, dans des étiives chaudees à iîO-2:2", et à 35", plusieurs tubes à essais renfermant les uns le lait normal, c'est-à-dire le lait fraîchement trait et non stérilisé, ou bien le lait stérilisr et additionné de microbes pathogènes, et les autres le même lait additionné de doses diverses d'antiseptiques; à diverses époques, on comptait, par la méthode des plaques de gélatine ,1e nombre de germes présents dans un centimètre cube de lait. Pour le carbonate et le bicarbonate de soude, M. Lazarus n'a pas dépassé la dose de 3 grammes par litre : c'est celle qu'on ne peut dépasser sans changer la saveur du lait. Comme ces sels donnent au lait une teinte brune pendant le chauffage, on stérilisait le lait à l'avance dans la vapeur d'eau bouillante; on y ajoutait ensuite le sel en solution stérilisée, et on faisait un nouveau chauffage d'un quart d'heure. La coloration du lait était alors à peine sensible. Le résultat le plus curieux de ces expériences a été que le carbonate de soude, pas plus que le bicarbonate, n'a sensiblement retardé le moment de la coagulation, tout en retardant le moment de l'acidifica- tion. Peut-être M. Lazarus s'en étonne-t-il trop; on sait, depuis les expériences de M. Pasteur sur la génération spontanée, que le lait peut se coaguler en restant neutre, et j'ai démontré que cela était dû à ce que certains microbes produisent une présure en tout identique à celle de la caillette du veau. Ces microbescoagulent ce lait parun mécanisme tout autre que les microbes producteurs d'acides. Ils se sont trouvés accidentellement avoir le pas dans les laits étudiés par M. Lazarus, mais il pourra y avoir et même il y a souvent des cas où les autres prédominent à leur tour, et où l'addition desels de soude retarde à la fois l'aciditicatioii et la coagulation. En d'autres termes, M. Lazarus a rencontré des faits contingents auxquels il a donné imprudemment une portée générale. Au sujet des microbes pathogènes, ses résultats sont mieux assis. Kitasato avait déjà vu que, dans les milieux les plus nutritifs, une dose de 2 "/n de carbonate de soude gênait le développement du bacille typhique, et une dose de 2, 2 "/o celui du bacille du choléra de Koch. Avec des doses de 2,1 7o pour le bacille du typhus, de 2,32 à 2, 47 °/o pour le bacille du choléra, il y avait arrêt; et mort respective- ment pour des doses de 2, 47 "/^ et de 2, 72 "/o- La précision de ces chiffres est un peu illusoire ; ils dépendent des conditions de milieu, de température, de vitalité de la semence, etc. Lazarus a opéré avec des doses plus faibles, et n'a pu constater aucune influence nuisible des carbonates de soude sur les microbes pathogènes qu'il a étudiés dans ce lait. Il a même constaté, au contraire, une influence favorable sur les spirilles du choléra, ce qui est sans doute dû à ce que ces microbes redoutent l'acide qu'ils produisent dans les milieux de culture 54 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. et aiment, à raison de ce fait, que ce milieu soit un peu alcalin. Avec l'acide salicylique, on n'a pas dépassé le dose de 75 centi- grammes par litre; au delà, la saveur du produit devient trop sensible. A cette dose, malgré l'augmentation d'acidité du lait, la coagulation est retardée de 2 ou 3 jours. C'est que l'acide salicylique est un anti- septique, retarde le développement des germes présents dans le lait, ou même les détruit après un contact assez long. Mais c'est surtout à 22° que cette action est manifeste, A 30°, il n'en reste parfois plus trace. Sur les microbes pathogènes, l'action de cet acide n'est pas moins énergique. Le bacille du choléra asiatique ne se développe pas en sa présence; bien plus, il périt en 6 à Qheures à 22", et en 12 à 24 heures à 35". Il faut pourtant que l'ensemencement ait été médiocre, car lorsqu'il est plus copieux, il y a développement. Le bacille de Finkler- Prior est aussi très sensible ; le bacille de Ribbert et celui d'Emmerich ont besoin d'une plus longue durée de contact pour périr. Le bacille du typhus abdominal est en revanche très résistant, et se développe à peu près aussi vite dans le lait salicylé que dans le lait normal. En somme pourtant, l'acide salicylique est un agent puissant de conservation. Heureusement il coûte cher, et comme il peut être dangereux, c'est à juste raison qu'il est proscrit de toutes les matières destinées à l'alimentation. L'acide borique est considéré comme moins dangereux. J'ai le regret de ne pouvoir me rendre à aucun des arguments mis en avant pour appuyer cette thèse, et qui sont les mêmes d'ailleurs pour toutes les thèses analogues. De ce qu'un animal à qui on fait avaler la substance à essayer ne commence à en souffrir que lorsque les doses deviennent trop fortes ou trop continues, on conclut que la substance est inofïen- sive pour l'homme. Je voudrais bien connaître quelqu'un assez pénétré de la force de ce raisonnement pour boire de la ciguë, sous prétexte que la chèvre la broute. Quoi qu'il en soit, l'acide borique ni le borax ne se sont montrés des antiseptiques très actifs dans les mains de M. Lazarus. Il est vrai qu'il n'a pas dépassé des doses de 4 à 2 grammes par litre pour l'acide borique, et de 3 à 4 grammes pour le borax. Liborius avaittrouvé que le bacille typhique dans le bouillon pousse encore avec 1,5 "/o d'acide borique, est gêné avec 2 "/o et n'est tué qu'à 2,7 "Z^. Pour le vibrion du choléra, les chiffres correspondants sont 0,43 °/o 0,8 "/o 1,33 "/gi ce sont de 10 à 20 fois les doses maximum de Laxarus qui a tort, je crois, de dédaigner les effets médiocres qu'il a obtenus. D'abord ces elïets sont sensibles dans toutes ses expériences, surtout pour le borax. Il a même une expérience dans laquelle les germes du choléra, semés en petit nombre dans des laits additionnés de 1 gramme par litre REVUES ET ANALYSES. 65 d'acide borique on de 2 grammes de borax, y avaient disparu au bout de 24 beures passées à 22". Il est vrai qu'à ;îo" dans les mêmes tubes, la mullipMcation s'était faite à peu près comme dans le lait normal, et que, même à 22", la présence de l'acide borique ou du borax ne gênent que faiblement les mêmes l)acilles du choléra lorsqu'ils sont introduits en quantité plus grande. Mais j'ai montré depuis longtemps que toutes ces irrégularités sont en quelque sorte des irrégularités normales, qu'avec une dose déterminée d'antiseptique l'effet dépend du nombre de microbes présents, de la température, etc., de sorte qu'on n'a pas le droit de faire (i d'un antiseptique parce qu'il n'accomplit pas tous les miracles qu'on lui demande. On pourrait trouver de nouveaux arguments en faveur de cette thèse dans les essais de Lazarus sur l'eau de chaux, qu'il a jugée inactive, tandis que Liborius lui avait attribué des propriétés antiseptiques très énergiques. Mais là encore les faits ne sont pas contradictoires en eux- mêmes ; ils ne le deviennent que lorsqu'on veut les ranger sous une formule commune. En résumé, tous ces moyens chimiques de conservation du lait se sont montrés singulièrement peu puissants au point de vue bactério- logique dans les essais de M. Lazarus, et nous nous trouvons très natu- rellement conduits à l'élude des moyens physiques de conservation, parmi lesquels les seuls utilisés jusqu'à ce moment sont le froid et la chaleur. Le refroidissement et la congélation du lait ne le débarrassent pas, comme on sait, de ses microbes. Ils ne sont pour lui qu'une protection temporaire, qui a besoin d'être permanente pour être eliicace, et qu'on ne rend permanente qu'à grands frais. La chaleur a, au contraire, un etl'et instantané, qu'on peut rendre plus ou moins complet en élevant plus ou moins haut la température.* Aussi a-t-elle été très étudiée. Je n'ai pas l'intention d'entrer dans l'examen individuel des mémoires écrits sur ce sujet : j'en résumerai seulement les principales conclu- sions en faisant un court historique du développement des idées et des découvertes. Lorsque l'hygiène et à sa suite l'industrie ont été amenées às'occuper de ce sujet, la scitmce possédait un certain nombre de faits assez solidement établis pour servir de jalons. On sait par exemple depuis longtemps qu'une simple ébuUition à 100", même faite dans des vases qui restent bouchés, et dans lesquels aucune contamination nouvelle n'est à craindre, ne suffit pas, le plus souvent, à préserver un lait de la coagulation. On sait aussi, depuis Gay-Lussac, qu'on arrive plus sûre- ment à ce résultat par plusieurs chaulTages successifs à 100", faits à 24 heures de distance l'un de l'autre. Entin M. Pasteur nous a nQ ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. appris qu'un seul chauffage de quelques minutes à 107° ou 108° suffisait à stériliser sûrement un lait quelconque. Au point de vue industriel, un chauffage au-dessus de 100° a l'in- convénient d'exiger un autoclave, ou l'emploi incommode de solutions salines. En plus, l'expérience a bientôt appris que ce lait chauffé à 107° prenait, si rapidement que le chauffage soit fait, une saveur spéciale, un goût de cuit qui déplaisait au consommateur. Plus on abaisse la température, moins ce goût de cuit est apparent. J'avais vu qu'il était à peine sensible quand on ne dépasse pas 70", et sous ce point de vue, les constatations de M. Bitter sont tout à fait d'accord avec les miennes. Comme d'un autre côté, la pasteurisation des vins se fait précisément au voisinage de 70". on s'est demandé s'il ne suffirait pas de pasteuriser les lails à la même température pour en assurer la conservation. De nombreuses tentatives ont été faites dans ce sens, et ont fait voir que le lait ainsi traité avait d'ordinaire une durée de conservation un peu supérieure à celle du lait naturel, mais quelquefois de très peu, de sorte que l'avantage du chauffage était problématique. Il ne saurait en être autrement. Le lait, recueilli dans les conditions ordinaires, est bientôt habité par des microbes très nombreux et très variés, dont quelques-uns ne résistent pas à l'action d'une température de 70°, mais dont la plupart s'en moquent. Il est même arrivé souvent, à l'origine, que le lait chauffé se gâtait plus vite que le lait non chauffé ; c'était lorsqu'on le laissait refroidir lentement, sous prétexte de le laisser plus longtemps sous l'action de la chaleur. On tuait bien ainsi, sans doute, quelques-uns des germes qu'un court séjour à 70» avait respectés ; mais ce lait qui refroidissait lentement, d'autant plus lentement que sa masse était plus grande, fournissait par contre de très bonnes conditions de température aux germes plus résistants, qui pouvaient éventuellement s'y multiplier plus vite que dans le même lait conservé à la température ordinaire. Pour obvier à cet inconvénient, on a été conduit à refroidir rapide- ment ce lait chauffé. Sa durée de conservation dépasse alors sûrement celle du lait naturel, mais de 2 ou 3 jours au plus. Pour augmenter cette survie, on s'est ingénié, on a multiplié et alterné les chauffages et les refroidissements, on a changé et rechangé la forme des appareils. Il y en a, ence moment, presque autant que de modèles de barattes, ce qui n'est pas peu dire, et ce sont les mêmes causes qui interviennent dans les deux cas. Un opérateur, n'ayant pas réussi avec un appareil, cherche dans la construction de cet appareil les raisons de son échec, qui n'y sont pas, puisqu'elles sont le plus souvent dans le lait et dans sa population variable. De là l'idée d'un changement de détails ou d'ensemble, changement qu'on réalise, qui réussit parce qu'il REVUES ET .VNALYSES. 57 finit naturellement par se plier à la nature du lait mis en œuvre, mais qui, insuffisant pour assurer la conservation d'un autre lait, conduit à l'idée de modifications nouvelles. J'ai donné, l'an dernier, [V. t. III, p. 30, et t. IV, p. 183) quelques renseignements sur quelques-uns de ces appareils, je n'y reviendrai pas. Je voudrais seulement signaler ce que la science a appris de nou- veau depuis un an sur ces laits pasteurisés. Le fait le plus curieux est celui que j'ai visé plus haut : l'absence de coliques, de diarrtiée verte, ou de désordres intestinaux chez les enfants nourris avec ce lait pasteurisé. J'ai ajourné tout à l'heure l'explication de ce fait. Je crois qu'on peut le mettre en regard de cet autre fait, révélé par la bactérologie et expressément noté par divers observa- teurs, que, dans ces laits pasteurisés, il n'y a plus guère que des bacilles, et que les micrococcus et les ferments lactiques sont presque toujours absents. Or, beaucoup de micrococcus, sans être devrais fer- ments lactiques, acidifient le lait en agissant sur son sucre; au con- traire les bacilles du lait sont presque exclusivement des ferments de la caséine, et rendent le lait alcalin. La pasteurisation à 70 ou 7oo a donc pour eil'et de donner le pas aux ferments de la caséine sur les ferments du sucre, à ceux qui coagulent le lait à la façon de la pré- sure sur ceux qui le coagulent à la façon des acides, et si on songe à la sensibilité de l'intestin du nourrisson vis-à-vis des liquides acides, à l'utilité de l'eau de chaux pour couper le lait dans certaines coliques, on conclura, je pense, qu'il y a toujours à redouter la présence desferments acidifiants dans le lait des biberons, et que le chauffage à 70o peut ren- dre des services, alors même qu'il ne tue pas tous les microbes présents dans le lait. Il fait seulement une sélection grossière de ceux qui sont nuisibles et de ceux qui peuvent être utiles. Voilà pour les bactéries en général. Si nous nous tournons mainte- nant du côté de celles qui sont pathogènes, nous allons encore trou- ver quelques faits intéressants. A quelle température faut-il chauffer le lait pour que certains microbes pathogènes y périssent. Rien ne nous dit a priori que ces températures soient les mêmes que dans d'autres liquides, ce qui nous dispense d'entrer dans l'examen des résultats, par- fois contradictoires en apparence, obtenus dans cette voie. Préoccu- pons-nous seulement du lait. Van Geuns avait trouvé, pour les températures minima qu'il suffit de laisser agir quelques secondes pour tuer les microbes pathogènes, les chiffres suivants : Spirille du choléra 58° Sp. de Finkler-Prior 58 à 59° Bacille typhique 60° Pneumocoque de Friedlaender 55 à 60° Virus vaccinal 60" 58 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. Lazarus a étudié la même question en se servant de l'appareil de pasteurisation de Thiel, duquel le lait sort dès qu'il a atteint une tem- pérature maximum, de sorte que le séio-jr à cette température maxi- mum est encore de durée très courte. Ici ce n'est guère qu'à 70" que le bacille typhique est à peu près sûrement tué; encore a-t-il résisté dans deux expériences à 75° et à TT". Le baciUus neapolitamis se comporte comme le bacille typhique, et n'est pas sûrement tué à 75° dans l'appa- reil de Thiel. Le bacille du choléra disparaît entre 62" et 70o. Le sta- phylococcîis pijogenes aureus est tué à 70o. Tous ces chiffres sont un peu supérieurs à ceux de Van Geuns, peut-être parce que le séjour à la tem- pérature maximum était moins prolongé. C'est ce que pense M. Bitter, qui a fait construire un appareil dans lequel le lait est chaufTé par un courant de vapeur circulant dans un serpentin, et peut être maintenu facilement pendant quelque temps à une température voulue en fer- mant convenablement la valve d'admission. 11 s'est convaincu, par ce procédé, qu'aucun des germes de maladie que le lait peut transporter, en particulier les germes de la tuberculose, ne résistaient à un chauf- fage de 30 minutes à 68°, et comme à cette température il n'y a aucun changement appréciable apporté à la couleur du lait, ni à sa saveur, il recommande ce mode de chauflage et l'emploi de son appareil pour tous les laits destinés à être consommés sans subir un nouveau chauf- fage. Ce lait, devenu inoffensif au point de vue hygiénique, peut en outre être conservé plus longtemps que le lait normal, surtout si on l'enferme dans des vases, stérilisés eux-mêmes en }' faisant passer, pendant 45 minutes, un courant de vapeur à 100° . Mais aucune de ces pratiques ne tue tous les germes, nous le savons, de sorte que cette solution, très satisfaisante au point de vue hj^giénique pour les laits qui doivent être rapidement consommés, ne peut s'appliquer au lait qu'on veut con- server longtemps ou faire voyager. Un chauffage à 100° , de quelque façon qu'il soit fait, est même im- puissant, nous le savons, à moins qu'il ne soit très prolongé. Mme E. Strub, qui a pris la peine d'étudier, à ce point de vue, les divers appa- reils de stérilisation qu'elle a pu réunir (Soltmann, Bertling, Gerber, Egli, Escherich,etc). dans lesquels le mode et la durée du chauffage à 100° sont très variés, à constaté qu'aucun d'eux ne débarrassait le lait de tous ses germes. Elle a même remarqué qu'il en restait obsti- nément un, liquéfiant la gélatine, qu'elle a pu identifier avec le hncilliis mesentericus ruUjatus de Flugge, et peut-être avec un bacille très résistant décrit par Globig dans un travail que nous avons analysé (ces Annales, t. II, p. 288). Les spores de ce bacille résistent àl heure et quart d'ébulUtion, et à tous les essais de stérilisation fractionnée qu'on peut faire sans altérer d'une façon irrémédiable la saveur et la couleur du REVUES ET ANALYSES. 59 lait. Le bacille que j'ai décrit sous le nom de Tyrotlirix tenuis est de la môme famille, et donne, comme je m'ensuis assuré, des résultats ana- logues. 11 y en a probablement d'autres, mais ceux-ci, qui sont très réi)andus. suffisent pour que tous les procédés de stérilisation du lait qui s'arrêtent à la température de 100" soient sujets à caution. Ces procédés peuvent, pendant des périodes plus ou moins longues, donner de bons résultats, jusqu'au moment où brusquement, par suite de l'intervention de microbes plus résistants, tout change, et où ce qui avait réussi ne réussit plus. On élève alors la température, et c'est ce que font peu à peu les fabriques de lait stérilisé. Seulement elles se heurtent alors à ce goût de lait cuit, sur lequel on ne sait malheureu- sement rien, de sorte que, pour l'éviter, on en est réduit à l'empi- risme. Il me semble qu'au lieu de marcher toujours plus avant dans cette voie, il serait utile de revenir en arrière, et de se demander s'il ne vaudrait pas mieux "éviter toute nécessité de chaufîage, en évitant abso- lument l'introduction des germes nuisibles dans le lait. Dans une con- férence faite le 7 juin 1889 au Trocadéro pendant l'Exposition univer- selle, je disais que « du lait proprement recueilli dans une étable bien tenue, et dans un vase bien nettoyé, par un vacher qui aurait bien lavé ses mains et les trayons de la vache, ne se coagulerait pas plus vite que du lait recueilli sans soins, et additionné de carbonate de soude pour masquer son défaut de propreté ». Cette idée, qui m'avait été suggérée par l'extraordinaire résistance que j'avais constatée, à mon laboratoire de Fau, pour du lait recueilli sous mes yeux dans des con- ditions très grandes de propreté, a été relevée par un de mes auditeurs, leD^Smester ', qui l'a appliquéeenNormandie et livreen ce momentà la consommation, dans Paris, du lait non chauffé, privé de tout antisepti- que, et dont la durée de conservation est très grande, même pendant les chaleurs. Il me semble que c'est de ce côté qu'est le progrès, au moins pour les laits destinés à être rapidement consommés, et non du côté de la multiplication ou du perfectionnement des appareils de pasteurisation. Il est vrai qu'une amélioration dans ce sens implique- rait l'introduction d'une propreté absolue dans les fermes et chez les fermiers, et on crée plus vite un outillage industriel qu'on ne réforme des habitudes traditionnelles. Mais les producteurs pourraient vite, si les consommateurs roulaient bien. Quand ceux-ci voudront du lait propre, ils l'auront. Ils auront toujours à le faire bouillir avantl'emploi, lorsqu'ils ne seront pas sûrs de l'état de la bête qui l'a fourni; mais la question n'en aura pas moins fait un grand pas quand laitiers et lai- tières sauront tous ce que c'est que la propreté. Dx. 1. M. Smester poursuit ses essais en vue de l'application en grand. 60 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. P. Behr. Sur une race de bacilles du lait bleu ne donnant plus de matière colorante. Centralbl. f. Bact. t., VIII. n« 16, p. 485. On sait depuis longtemps que le baciltus prodigiosus et le bac. pyocyaneus perdenl, dans certaines conditions de culture, leur colora- tion caractéristique, mais la récupèrent lorsqu'on les transporte et qu'on les cultive pendant quelques générations sur un milieu conve- nable. On n'a encore que de rares exemples de microbes colorés donnant naissance à une variété incolore permanente. Heim a parlé {Arb. a. (l. k. Gesundh. t. V,p. 526) d'une variété de bacille du lait bleu ne don- nant plus de matière colorante. Au laboratoire de M. Lehmann, à Wurzbourg, on cultive 4 races de ce même bacille dont l'une, provenant de l'Institut hygiénique de Berlin, reste depuis février 1889 tout à fait incolore dans des cultures sur gélose et gélatine. Craignant qu'il n'y ait eu une substitution quelconque, M. Behr a entrepris de comparer cette variété incolore aux trois autres, et a constaté que, sauf la for- mation de matière colorante absente chez l'une, elles se ressemblaient sous tous les points de vue. Dans toutes, par exemple, on a observé les cils à l'aide de la méthode de coloration de Lœffler par la teinture de fuchsine. Sur la pomme de terre pourtant, la variété incolore donne une teinte jaune brun, et on pouvait penser qu'une série de cultures sur ce milieu rendrait au bacille sa puissance colorante sur la gélatine et la gélose ; mais il n'en a rien été, et même du lait, ensemencé avec des bacilles de 4^- génération sur la pomme de terre, est resté incolore. M. Behr rapproche avec raison cette perte du pouvoir colorant des pertes de virulence ou de pouvoir diastasigène qui ont été relevées déjà chez de nombreux bacilles. Mais ce qui serait plus intéressant, ce serait de découvrir les causes de ce phénomène, ou du moins les circonstances prochaines de son apparition : c'est presque toujours le hasard qui l'a fait naître. On ne le connaîtra vraiment bien que lorqu'on saura passer sûrement de la variété colorée à la variété incolore, et réciproquement. Dx. H. ScHOLL. Sur le poison du choléra. Prmj. Med. Wochenschr., 1890, no44. M. Scholl a cherché, dans la voie ouverte par son maître, M. Hueppe, l'influence que pouvaient avoir sur la production du poison cholérique, la culture à l'abri de l'air et dans un milieu appro- REVUES ET ANALYSES. «U prié. Il a cultivé le vibrion du choléra dans des œufs, dont il letrou- vait, au bout de 18 jours de culture, l'albumine liqiiétiée et de couleur gris jaunâtre, tandis que le jaune avait une teinte noire et une consis- tance presque solide. Délaissant ce jaune, il n'a étudié que l'albumine, de laquelle il n'aréussi à retirer aucune substance à selscristallisables, pouvant être considérée comme une ptomaïne, soit qu'il ait employé la méthode de Baumann et Udransky, soit celle de Brieger. Cette albumine était pourtant toxique, plus toxique qu'un produit quelconque de culture au contact de l'air, car si on en injectait Ooc dans le péritoine d'un cobaye, on voyait apparaître, aussitôt après l'injection, la paralysie d'abord des extrémités antérieures, puis des extrémités postérieures ; après 15 minutes se manifestaient des crampes d'abord légères, puis de plus en plus violentes dans les membres; l'animal se refroidissait, ses poils se redressaient et il mou- rait 40 minute.'^ après l'injection. L'autopsie montrait un exsudât incolore dans le péritoine, une injection notable des vaisseaux sanguins de l'estomac et de l'intestin grêle, une hypérémie notable des reins, et le cœur arrêté en diastole. Pour tâcher d'isoler la substance active, l'albumine a été coulée goutte à goutte dans 10 fois son poids d'alcool absolu. Le précipité formé tombe en partie au fond, et va en partie à la surface. On ne devine pas bien pourquoi M. SchoU sépare et étudie à part ces deux parties du précipité. La portion qui monte à la surface y est, selon toute apparence, entraînée par les bulles d'air qui se dégagent au moment où l'alcool absolu se dilue, et rien n'autorise à croire qu'elle soit absolument différente de celle qui se réunit au fond du vase. Quoi qu'il en soit, la couche superficielle isolée se redissout facile- ment dans la potasse, d'où l'acide acétique la précipite de nouveau sans qu'elle puisse se dissoudre dans un excès d'acide. Elle se dissout aussi dans une solution à 7 0/0 de sel marin. La solution donne la réaction du biuret et de l'acide xanthoprotéique, mais aucun précipité avec l'acide acétique et le ferrocyanure de potassium. En appliquant avec recueillement les formules du Credo en honneur sur ces matières, M. SchoU en fait une globuline. C'est un point sur lequel nous ne le chicanerons pas. Les microbiologistes croient trop aux chimistes, faute d'avoir assez fait le tour de leurs idées, et de même les chimistes pour les microbiologistes. Il est bon de saupoudrer d'un peu de scepti- cisme les plats qu'on consomme et même ceux qu'on prépare, et la science se serait évité bien des déceptions pénibles en se souvenant dans ces derniers temps de cette règle de conduite. Ce qu'il y a de plus intéressant que cette question de nom, c'est que quelques centimètres cubes d'une solution de cette substance dans de la potasse étendue, injectés dans le péritoine d'un cochon d'Inde, 62 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. amènent après quelques minutes des crampes des extrémités, et tuent l'animal en 20 minutes, avec cœur arrêté en diastole, exsudât séreux dans le péritoine, et reins, estomac et intestin grêle intacts en 'apparence. Cette globuline, dit M. SchoU, est donc toxique; c'est une toxo-globiiline. Arrivons maintenant au dépôt tombé au fond du vase. On le recueille sur un filtre, on le lave à l'alcool, et on le laisse digérer 20 minutes avec de l'eau à 40". Il s'en dissout très peu, et pourtant, en injectant dans le péritoine d'un cobaye 8'^^ Jq liquide filtré, on voit la paralysie apparaître aussitôt après l'injection^ et l'animal mourir quelquefois en 2 ou 3 minutes. A l'autopsie, on trouve le cœur en diastole, les reins bypérémiés, un exsudât sanguinolent dans le péri- toine et une forte injection des vaisseaux de l'intestin. En diluant la liqueur injectée, la période de paralysie devient plus apparente. Elle est suivie de convulsions rythmiques des extrémités, et la mort tarde plus ou moins à venir, mais jamais plus de 3 heures. Un autre point à remarquer, c'est que cette solution avait une puissance toxique supérieure à celle de l'albumine originelle. « Tandis qu'avec l'albu- mine d'un seul œuf, on pouvait tout au plus tuer 5 à 6 animaux dans l'espace de 2 à 3 heures, on pouvait, avec la solution de toxine prove- nant de l'albumine d'un seul œuf, tuer 10 animaux mourant en 10 minutes. « L'étude chimique de cette solution a montré qu'elle donnait la réaction du biuret et de l'acide xanthoprotéique, mais ne fournissait aucun précipité avec l'acide acétique et le ferrocyanure, ni quand on la saturait par le sulfate d'ammoniaque ou le sulfate de magnésie. Comme elle était précipitée d'un autre côté par le sublimé, le nitrate de mercure, la solution de tannin et l'acide phosphomolybdique, M. Scholl la considère comme contenant une peptone, une choléra- to.ropeptone. Voilà donc cette malheureuse confiance dans la chimie qui pousse M. Scholl à voir deux toxines différentes dans les produits des vibrions du choléra, alors que s'il était resté simple physiologiste, il n'aurait probablement pensé à n'en voir qu'une, agissant avec des symptômes et une rapidité variable, suivant la dose injectée et sa plus ou moins facile résorption. Il aurait au moins pensé à faire pathologiquement la preuve de cette dualité ; mais point : il se rejette sur la Chimie, ignorant que si la question des toxines est l'obscurité, la question des matières albuminoïdes est la nuit profonde, et qu'on n'éclaire pas les ténèbres par les ténèbres. Ce qu'il y a de piquant, c'est qu'il démolit lui-même sa construction en étudiant l'influence de la chaleur sur sa substance toxique, qui perd toute activité après une demi-heure de chauffage à 100» .Une REVUES ET ANNALYSES 6:i demi-heure de chaulïage à 75o n'a pas d'effet, mais pour une durée plus longue, le poison est détruit. Or les peptones ont pour caractère de résister à réluillition. Elles sont aussi assez stables, tandis que la toxine de M. SchoU ne résiste pas à la dessiccation dans Je vide à 40" ou 45^ Mais ces critiques, qui ne portent que sur des questions d'interpré" talion, ne visent pas le fond du travail, pour lequel M. SchoU réclame légitimement le mérite d'avoir appris à préparer, au moyen de la bactérie du choléra menant une vie anaérobie dans l'albumine, une matière toxique amenant des symptômes plus voisins des symptômes du choléra chez l'homme que toutes celles qui avaient été décrites jusqu'ici. Faisant suite aux recherches de Hueppe et Wood sur le même sujet, celles de M. Scholl fournissent un argument nouveau dans la controverse entre l'École de Munich et l'École de Berlin que nous avons résumée dans une revue récente. (V. ces Annales, t. IV, p. 299.) Dx. INSTITUT PASTEUR Personnes traitées mortes de la rage. BIREBENT Jules, 21 ans, maréchal-ferrant, à Pamiers, Ariège. Mordu le 10 octobre 1890, par un chien reconnu enragé par M. Mire,, vétérinaire sanitaire; 1° à Tavanl-bras droit, quatre blessures ;. 2° an pouce gauche, deux blessures ; toutes sont pénétrantes et ont beaucoup saigné. Birebent a été cautérisé au fer rouge par un médecin un quart d'heure après la morsure. Il a été traité du 14 octobre au 2 novembre. Le 29 novembre, Birebent est pris de malaise, les cicatrices des blessures du poignet et de l'avant-bras droit gonflent et prennent une teinte livide. Il succombe à la rage convulsive le 1'''' décembre. (Ren- seignements fournis par le docteur Allana.) ERliATUM. Dans le dernier article de. M. Winogradsky, t. IV, p. 767, 4« ligne de la note, lire dosables au lieu de considérables. ■ 64 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. INSTITUT PASTEUR STATISTIQUE ' DU TRAITEMENT PRÉVENTIF DE LA RAGE. — DÉCEMBRE 1890. Morsures aux mains Morsures à la tête ( simples et à la figure ( multiples . . . . Cautérisations efficaces — inefficaces Pas de cautérisation simples multiples . . . . Cautérisations efficaces — inefficaces Pas de cautérisation Morsures aux mem- (simples bres et au tronc \ multiples . . . . Cautérisations efficaces — inefficaces Pas de cautérisation Habits déchirés Morsures à nu Morsures multiples en divers points du corps Cautérisations efficaces — inefficaces Pas de cautérisation Habits déchirés Morsures à nu Totaux. Français et Algériens Etrangers 13 31 B 14j 14 28 B » » » » y) 11 11 22 )» >» >1 W » » » >t » )) 1 1 )) » » »> » » » » » » 45 6 51 Total général 98 » / 2/ 7i 9 3/ 7 4( 14/ 2* 16 4. La colonne A comprend les personnes mordues par des animaux dont la rage est reconnue expérimentalement; la colonne B celles mordues par des ani- maux reconnus enragés à l'examen vétérinaire; la colonne C Jes personnes mordues par des animaux suspects de rage. Les animaux mordeurs ont été S fois. chiens, 93 fois ; chats, Le Gérant : G. Masson. Sceaux. — Imprimerie Charaire et fils. 5"" ANNkE. FEVRIER 1891. N» 2 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR DES RACES DU BACILLE PYOCYANIQUE ParM.C.GESSAKD. Travail du laboratoire de chimie biologique de la Sorbonne, à l'Institut Pasteur. J'ai étudié dans un précédent mémoire ' la fonction chro- mogène du bacille pyocyanique. J'ai montré qu'il produisait plusieurs pigments, et que la nature du pigment variait pour un même germe avec la composition du milieu oii ce germe était implanté. Mes recherches portaient sur un organisme que J'avais isolé d'un pansement; l'étude parallèle de deux autres orga- nismes d'origines différentes me permit d'attribuer quelque généralité à mes conclusions. J'ai dû me demander pourtant dans quelle mesure le rapport que j'avais établi entre le milieu nutritif et le pigment était constant et nécessaire, et pouvait être étendu à tous les germes de quelque provenance qu'ils fussent ; si des exceptions ne pouvaient pas se produire spontanément ou être artificiellement provoquées, et se perpétuer ensuite par voie de descendance. En un mot, peut-il exister des races du bacille pyocyanique ? Mais avant d'exposer les faits qui répondent à cette question, il ne me paraît pas sans utilité de revoir rapide- 1. Ces Annales, t. IV, p. 88. m ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. ment comment la notion de race s'est développée en microbie, quels attributs des espèces microbiennes sont susceptibles de variations, et quelle est la nature de ces variations dont la transmission héréditaire constitue la race au sens habituel du mot. I La notion de race a été introduite en microbie par M. Pasteur, dans ses Études sur la bière, à propos des diverses sortes de levures alcooliques qui s'offraient à sou observation. M. Pasteur n'a pas donné de noms particuliers à ces diverses levures, craii^nant d'attacher trop d'importance aux caractères exté- rieurs, et « ayant constaté maintes fois que des formes, en appa- rence distinctes, appartiennent souvent à une même espèce * «. Ces variétés morphologiques, reconnues ainsi dans l'espèce dès le début de la science nouvelle, eussent pu servir sans doute à l'établissement de races. Mais la race, ainsi que l'espèce, doit être fondée sur d'autres bases que les caractères extérieurs. « Des formes semblables peuvent aussi cacher des différences profondes - > . Et l'œuvre entière de M. Pasteur fonde d'abord sur la connaissance des fonctions physiologiques la distinction des organismes microscopiques. Cet élément primordial de diagnose microbienne dans l'œuvre de M. Pasteur est invoqué pour les levures, dès la note sur quelques faits nouveau.r au sujet des levures alcooliques, dans le Bulletin de la Société chimique, 1862, p. 74. 11 faut, dit l'auteur, suivre avec attention « la durée de la fermentation, les proportions des substances qui prennent naissance, si l'on veut arriver à quelques conclusions certaines au sujet de l'identité ou de la différence des diverses levures alcoo- liques ». Ce sont les fonctions physiologiques plus que les carac- tères morphologiques, qui distinguent la levure haute et la levure basse de brasserie, provenant d'un germe unique peut-être, et offrant « un exemple nouveau de ces modifications de plantes ou de races d'animaux, devenues héréditaires par une domestication prolongée • » . Voilà formulée la conception de race. Elle se précise 1. Etudes sur la bière, p. 148. 2. Ibid. 3. Ibid. p., 18o. RACES DU liA<:iI.LE PYOCYANinUE. 67 plus loin en quelques lignes où est contenu un plan d'études qui sera étendu des levures à toutes les espèces microbiennes. « Une levure est une réunion de cellules qui ne sauraient être indivi- duellement identiques. Chacune de ces cellules à des propriétés d'espèce ou de race qu'elle partaj^e avec les cellules voisines, et, en outre, des caractères propres qui la distinguent, et qu'elle est susceptible de transmettre dans des générations successives. Si donc on parvenait à isoler, dans une levure déterminée, les diverses cellules qui la composent, et qu'on pût cultiver à part chacune d'entre elles, on obtiendrait un nombre égal de levures qui, vrai- semblablement, seraient distinctes les unes des autres, parce quelles participeraient chacune des propriétés individuelles de leur cellule d'origine... Ce serait probablement un moyen de créer des races de levures distinctes' . » La découverte française de l'atténuation des virus a réalisé la création de races aux dépens des bactéries pathogènes. Le microbe du choléra des poules peut être pris à un stade quel- conque de l'atténuation due à l'oxygène de l'air, et transmettre à des générations successives le degré de virulence oii il était par- venu, et qui est la seule caractéristique de la race ainsi formée. 3L Pasteur s'est assuré^ « qu'il n'existe pas de correspondances morphologiques entre le parasite et les diverses virulences qu'il accuse; les cultures sont pareilles pour toutes les virulences ». Nouspouvons ajouter tout de suite qu'elles semblent aussi avoir les mêmes besoins nutritifs. A.vec la bactéridie charbonneuse, les virulences diverses sont fixées dans la spore, et la stabilité des races correspondantes est ainsi assurée dans le temps, sans qu'il soit besoin de les laisser en contact avec les agents qui leur ont donné naissance. Mais la virulence d'un microbe n'est pas une propriété au sens strict du mot; c'est un fait d'ordre complexe, où est impli- qué un autre être vivant que le microbe. Elle naît du conflit de ces deux organismes vitaux : elle est la résultante de leur réac- tion réciproque. De cette notion sont résultés de nouveaux carac- tères distinclifs. Avec le choléra des poules, le charbon, tous les animaux adultes d'une même espèce se comportaient à peu près 1. Études sur la bière, \}. 193 et l'J4. 2. Comptes rendus, 1880, t. XCI, p. 677. 68 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. de la même façon, et donnaient la môme mesure pour la viru- lence du microbe et l'étude de ses variations. Le rouget du porc fit intervenir la considération de la race même dans l'espèce ani- male employée à cet eiïet. C'est dans cette dépendance étroite de la forme, du milieu de culture du microbe, du milieu vivant où il est introduit, que la distinction des races s'est établie d'après les virulences variables des microbes pathogènes. Les caractères extérieurs ont pu servir aussi, plus tard, à l'établissement de races. Les espèces chromogènes en ont fourni les premiers exemples. La fonction dont la persistance doit fournir dans ce cas le point de repère de la diagnose spécifique est ici facile à vérifier, puisque c'est la production d'une coloration corrélative et synchrone au développement même de la culture in vitro. Cette fonction peut être atteinte alors que la forme sub- siste. Mais pour constituer des races, ces variations doivent toujours se retrouver dans le milieu originel oii la forme et la fonction sont normales. Bans les cas de dégradation profonde et simultanée de la forme et de la fonction, le caractère de race ne sera plus reconnu qu'autant que, par un artifice quelconque, on pourra, ou ressus- citer la fonction dans des conditions nouvelles, ou amener le microbe à la reproduire dans les conditions habituelles. En dehors de ce cas, c'est l'espèce même dont l'identité devient incer- taine, il n'y a quasi rien à répondre au soupçon d'une substitu- tion accidentelle dans la série des expériences qui ont conduit du microbe originel à un microbe qui n'a rien conservé de ce qui constituait son ancienne individualité. II La question de l'existence de races du bacille pyocyanique comporte mieux qu'une solution théorique, depuis les travaux de Wasserzug, parus dans ces Annales ' . Les recherches de Was- serzug- ont porté successivement sur la fonction et la forme. Il a montré qu'on peut « abolir d'une façon permanente la fonction productrice de matière colorante, dans les milieux pour lesquels 1. T. I et II. RACKS DU BACILLE PYOCYANIQUE. 69 cette fonction est normale ». D'un autre côté il a pu « modifier la forme assez profondément pour que le microbe, rapporté dans son milieu originel, y prenne et y conserve une forme diffé- rente de la forme primitive ». C'est le bouillon qui servait à ces cultures. Le bouillon est resté le milieu banal oiïert au dévelop- pement des microbes. Ce liquide ne facilite guère, à la vérité, l'analyse des conditions physico-chimiques du développement; avec lui, on ne fait que substituer aux milieux physiologiques, où s'entretient d'habitude l'activité cellulaire, un milieu qui, pour être artificiel, n'est pas moins complexe, et dont la composition n'est guère mieux connue. Mais, à raison de cette complexité même, le bouillon fournit aux besoins variés des divers microbes et aux substances diverses qu'ils élaborent. J'ai montré qu'ainsi le bacille pyocyanique y donne naissance simultanément à deux pigments, qu'il ne produit qu'isolément et à l'exclusion l'un de l'autre dans d'autres milieux moins complets. C'est aussi la réac- tion pigmenlaire du bouillon qui distingue les races que je vais décrire. Des propriétés de race rendent seules compte des varia- tions des effets dans un milieu invariable. ITI Je rappellerai d'abord les caractères que j'ai reconnus au germe qui peut être pris pour type de la race la plus parfaite, du bacille pyocyanique normal, et que, pour abréger, je dési- gnerai par la lettre A. La culture dans le bouillon donne à la fois pyocyanine et fluorescence verte. Cette dernière apparaît seule dans les cul- tures dans l'albumine d'œuf. Les milieux, peptone et gélatine, l'excluent au contraire, et la pyocyanine y prédomine, accom- pagnée d'un pigment verdâtre. L'addition de glucose à ces derniers milieux supprime la pyocyanine, et laisse se développer seul ce troisième pigment. J'ai cherché si, en réduisant le microbe à la fonction que j'appellerai iluorescigène, pendant un long temps et pour des générations nombreuses, il ne serait pas possible de le rendre inapte à produire de la pyocyanine dans les milieux favorables à la production du pigment bleu. Le résultat a été tout différent. 70 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR, La culture en série dans l'albumine a compris trentre-quatre passages échelonnés sur plus d'une année. Le microbe a été ensuite reporté dans le bouillon. Comme s'il était alors devenu, par l'habitude, plus exigeant sur l'état où doivent lui être ofl'erts les éléments de la production de fluorescence, c'est la fonction pyocyanogëne qui a prévalu, et qui subsiste seule après quelques passages en bouillon. C'est l'origine de la race que je désignerai par la lettre P. En revanche la chaleur a donné le résultat que j'avais demandé en vain à l'éducation en milieu albumineux. Une cul- ture dans le bouillon de la race A, après cinq minutes de chauf- fage à 37'^, n'a donné que de la fluorescence par ensemencement dans un matras de bouillon, premier terme d'une série de cultures où la fonction fluorescigène seule persiste. C'est la race F. La sensibilité de la fonction pyocyanogëne à l'action de la chaleur peut servir encore à créer une autre race. Reprenons la race P, qui n'est apte à produire que de la pyocyanine, et portons de même une de ses cultures dans le bouillon à la température de ol", pendant cinq minutes. Employons-la ensuite à ensemencer un nouveau bouillon. Il n'en résulte qu'un trouble : le dévelop- pement du microbe a lieu sans production d'aucun pigment. C'est une race sans pigment S, comme celle que Wasserzug avait obtenue de l'emploi des antiseptiques. Nous possédons ainsi quatre races de bacille pyocyanique : A, qui donne pyocyanine et fluorescence. P, qui donne pyocyanine seule. F, qui donne fluorescence seule. S, ni fluorescence, ni pyocyanine. La culture dans le bouillon ne distinguerait donc plus le microbe de la race S du groupe nombreux des bactéries sans pigment. La race F, quoiqu'elle ait retenu une fonction chromo- gène, ne se garderait pas mieux de la confusion, en présence du grand nombre de microbes producteurs de fluorescence. Mais soumettons les deux organismes à l'épreuve du milieu gélose- peptone glycérinée, que j'ai reconnu si favorable à la production de pyocyanine. Le caractère spécifique de nos microbes va s'y retrouver, la fonction pyocyanique reparaître. La couleur bleue -RACES DU BACILLE PVOCYANIOUE. 71 ne diffère même pas en inlensilé de celle qn'o nobtient dans le même milieu avec les races A et P. Des phénomènes de coloration, de tous les plus faciles h distinguer, montrent ainsi d'une manière frappante ce qui ne peut être méconnu dans aucun phénomène d'origine micro- bienne, l'inflnence respective du microbe et du milieu, la subor- dination de l'elTet à cette condition élémentaire de leur réaction réciproque, que le milieu fournisse certains éléments que le mi- crobe doit être apte à utiliser. L'aptitude du microbe peut être abolie d'une manière défini- tive, et ne se réveille pas alors dans les conditions de milieu les plus favorables : c'est ainsi que dans l'albumine même, plus propre que le bouillon à entretenir la fonction fhiorescigène, les germes P et S se développent sans plus donner de fluorescenc(i. Nous venons de voir, au contraire, pour la fonction pyocyano- gène, l'aptitude des races F et S, abolie dans le bouillon, repa- raître dans la gélose-peptone glycérinée. C'est sous la réserve de ces aptitudes fonctionnelles oii les races se différencient, que la distinction entre les milieux subsiste telle que je l'ai établie, et se résume -ainsi pour le bacille pyocyanique : l'albumine et le bouillon sont nécessaires à la fonction fluorescigène, mais n'excluent pas lafonclionpyocyano- gène; lapeptone exclut la première fonction d'une façon absolue et convient particulièrement à la seconde. On est fondé à attribuer à ces modifications de propriétés du ba- cille pyocyanique un sens général d'affaiblissement, de diminution, soit que l'on considère l'agent employé, la chaleur, et ses effets habituels, soit que l'on considère le microbe, dont il est naturel de regarder comme des types dégradés les races à un seul pigment ou sans pigment, et pour qui, d'ailleurs, ces modifications s'ob- tiennent au voisinage immédiat du degré de température qui supprime même sa vitalité : aucune race, en effet, n'a résisté à la température de oO" pendant cinq minutes. Mais cette conclu- sion, est-il besoin de le dire? ne va pas au delà de la fonction pigmentaire du bacille, à laquelle se borne actuellement mon 72 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. étude : le chauffage à 57°, qui l'avait réduit à la production de fluo- rescence, avait laissé sa virulence au même point, comme en témoig-na une expérience comparative sur le lapin avec les races A et F. Les moyens varient d'obtenir les résultats que j'ai mention- nés, et ne laissent pas place à une interprétation différente de ces résultats. Ainsi, une race sans pigment a été obtenue aux dépens de la race P, en mettant à profit une modification spon- tanée dans ses cultures, un affaiblissement de la couleur dont il serait difficile de dire la cause, dû, peut-être, à un changement de bouillon (il n'en est pas deux qui se ressemblent), à une diffé- rence légère de température, chose fréquente dans une étuve commune, etc. La dégradation a pu se suivre ici, pour ainsi dire pas à pas, par la faiblesse croissante de la réaction pigmentaire dans les cultures successives, que je renouvelai à de courts inter- valles, jusqu'à l'abolition définitive de la fonction chromogène. Dans une autre expérience, c'est la fonction fluorescigène qui s'arrête à un degré de l'échelle de déchéance qu'elle descend sous l'influence de la chaleur. Un degré de plus que la tempé- rature qui a produit la race F aux dépens de A, 38°, appliqué pendant 5 minutes à une culture de F dans le bouillon, l'a amenée au point de ne plus développer de pigment dans ce milieu, oii elle se confondrait désormais avec les races incolores déjà obte- nues. Mais transportons-la dans le même milieu solidilié parla gélose. Les bacilles fluorescents en général, témoignent de la supériorité de cette gélose au bouillon sur le bouillon ordinaire pour favoriser leur fonction. La nouvelle race la vérifie à son tour par la production de fluorescence, ce qui prouve chez elle une déchéance moins profonde que celle de la race S, qui reste inco- lore dans les deux milieux. La fonction fluorescigène résiste donc mieux à la chaleur que la fonction pyocyanog^ène. Mais elle n'en est pas moins détruite flnalement, et pour le milieu même qui réalise les condi- tions les plus favorables à sa production. La fonction pyocya- nogène, au contraire (et ceci est bien fait pour lui maintenir le premier rang- dans la biologie du microbe), se retrouve dans le bacille, même dépouillé par la chaleur de toute fonction chromo- gène en bouillon. Dans son milieu approprié, elle ne se sépare pas de l'évolution vitale du bacille. RAGES DU BACILLK PYOCVANIQUE. Les effets obtenus sur le bacille pyoycanique sont donc de l'ordre de ceux qu'on réalise habituellement invirro, et quiontl'at- lénuation pour expression commune et pour cause la dégénéres- cence vitale. Peut-on remonter ces types dégénérés, rendre une des fonctions chromogènes aux races sans pigment, la fonction abolie à celles qui n'en possèdent plus qu'une? Les tentatives dans ce sens, in vitro, sont demeurées infructueuses. Si les diverses étapes de la déchéance fonctionnelle sont facilement parcourues dans les expériences de laboratoire, en concurrence dans ce cas avec le procès vital, la marche inverse, le rétablis- sement dans son intégrité de la fonction déchue, ne s'obtient guère qu'avec l'aide de la vie, par la culture des microbes dans un milieu vivant. J'étais ainsi conduit à étudier ce que devien- nent les différentes races dans le corps dos animaux. Ces expériences se poursuivent. J'en mentionnerai deux seulement. L'une a trait à la race A. Elle a subi sous l'action de l'organisme la même modification que par l'action de la chaleur. Un lapin, du poids de 1,990 grammes, a reçu dans la veine de l'oreille un demi-centimètre cube d'une culture dans le bouillon, âgée de trois jours, et est mort en quarante-huit heures. Quel- ques gouttes de saug du cœur ont donné dans le bouillon une culture exclusivement fluorescente. La suppression de la fonction pyocyanogène s'est maintenue dans les ensemence- ments en série. Le même caractère appartenait à un germe que M. Metchnikoff m'a remis, provenant du passage par de nom- breux lapins d'un bacille qu'il tenait de M. Gharrin, et qui donnait bien de la pyocyanine, à l'arrivée dans son laboratoire. Dans la seconde expérience, un lapin, du poids do 1,700 grammes, a reçu dans la veine de l'oreille un demi-centi- mètre cube d'une culture de la race P dans le bouillon, âgée de trois jours. La mort survient au bout de quinze jours. Quelques gouttes d'urine ont donné une culture sans pigment, et ce caractère se maintient tel dans les cultures successives. L'iden- tité du bacille pyocyanique a été vérifiée dans les deux cas par l'épreuve sur gélose-peptone. Les races A et P ont donc subi 74 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. du passage daas l'organisme du lapin la même altéralion que de l'action de la chaleur. Voici en résumé les races que je possède et les conditions de leur production : Race type, à fluorescence et pyocyanine, venant d'un pansement ; — fluorescigène, par chaleur sur la race type; — — par passage de la même dans le lapin ; — pyocyanogène, par culture en albumine de la race type ; — sans pigment, par dégradation spontanée delà race pyocyanogène ; — — par chaleur sur la même; — — par passage de la même dans le lapin; — — par chaleur sur la race fluorescigène. On imagine aisément des types de races intermédiaires. Ils pourraient être obtenus, par exemple, dans l'action lentement modificatrice de l'albumine sur le microbe, suivant le chiffre de la série auquel on emprunterait la semence à reporter dans le bouillon. La morphologie ne fournit pas de caractères distinctifs entre ces différentes races. On peut noter une tendance aux formes longues de filaments flexueux, pour les races sans pyocyanine en gélatine-bouillon. Mais c'est un caractère transitoire qui s'atténue ou disparaît par retour en milieu liquide. Je n'insis- terai pas davantage sur l'aspect des colonies dont on a décrit la forme rayonnée, les fins prolongements radiés; ni sur la liqué- faction de la gélatine dont on étudie si minutieusement la durée, l'aire de progression, etc. Les colonies ont été rayonnées ou festonnées pour un bouillon, arrondies pour un autre, rondes généralement, et quelle que fût la race, pour les milieux gélatine, gélaline-peptone. Peut-être les races sans pyocyanine liquéfient- elles plus vite. Ce sont des faits sans importance. Il est plus intéressant de noter que les cultures de ces dernières sont dépourvues de l'odeur aromatique, qui appartient, au contraire, aux races P et A. VI On conçoit que les résultats que j'ai obtenus dans des conditions déterminées, pourront dépendre de condilions différentes,, ou réglées par l'expérimentation, ou réalisées IWŒS DU BACILLE rVOGYANinUE. n dans les conditions naturelles d'apparition du bacille pyocya- nique. Le milieu i;élose-peptone glycérinée permettra, dans tous les cas, de retrouver la léactiou caractéristique de l'espèce, pour les variétés nombreuses que peut offrir celte dernière. Dans les recherches physiologiques, c'est un germe qui, inoculé à un animal et reporté de son corps dans un milieu de culture, peut donner, comme nous l'avons vu, une réaction pigmentaire différente de celle qu'il offrait d'abord et qui le ferait confondre avec d'autres germes ; on verra parfois le résultat varier suivant l'humeur de l'animal en expérience à laquelle la semence est empruntée, et même suivant la portion ensemencée de cette humeur ^ En clinique, c'est fréquemment l'odeur caractéristique qui fait diagnostiquer la présence du bacille pyocyanique, sans qu'il se révèle par une coloration manifeste. Ce sont les différentes races qui peuvent se rencontrer dans les différents pansements bleus, ou dans un même pansement-, selon les parties qui seront ensemencées. Quelque circonstance semblable a favorisé mes pre- mières recherches, où le microbe, que je cultivai dans la salive, ne donna que de la pyocyanine dans ce milieu si propice à la fluorescence K On expliquerait par les mêmes causes les diver- gences entre les observateurs de Berlin et de Breslau et ceux de Hcidelberg sur les caractères du bacille pyocyanique*. Si, comme il est vraisemblable, le bacille a de M. Ernst ne repré- l.J'ai ensemencé deux matras du même bouillon avec nombre égal de gouttes d'urine du lapin dont le sang m'a donné une race fluorescigène. L'un des matras a montré pvocyaniue et fluorescence, l'autre, fluorescence seulement ; mais la pyocyanine a reparu dans le nouveau matras qu'il a servi à ensemencer. 2. Cette vue doit être préférée. Elle est plus conforme à la vérité et plus sugges- ti^e. Elle revient à l'idée pastorienne do l'individualité de chaque cellule de levure. Elle conduit Wasserzug (loc. cit.) à poursuivre des cultures homogènes, c'est-à-dire, « dont toutes les cellules soient capables de produire le pigment dans un milieu donné. » Mais il reconnaît aussi vite la vanité de l'entreprise, des différences indi- viduelles se produisant de nouveau et s'accentuant à mesure que la culture vieillit. 3. J'étais d'autant plus apte à reconnaître ce phénomène de la fluorescence, dès cette époque, et attentif à son apparition, que j'avais débuté en microbie par 1 étude d'une espèce fluorescente, et que, dans mes idées d'alors, j'eusse imputé la fluorescence à une altération de mes cultures par cette espèce. C'est ce que j'ai fait, d'ailleurs, quand, ayant emprunté à un autre pansement la semence pour une culture à l'air libre en milieu albuniineux, j'ai vu apparaître une fluorescence que j'ai attribuée à un bacille banal, alors qu'elle pouvait appartenir ù un bacille pvocvani([ue fluorescigène. (De la pyocyanine et de son microbe. Appendice. Note'l.) A. Voyez mon mémoire précédent. 76 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. sente qu'une race à fonction iluorescigène prédominante, il doit reproduire de la pyocyanine dans les conditions de milieu spé- cial que j'indique. Enfin, c'est dans le corps de l'homme même ' qu'on doit s'attendre désormais à rencontrer le bacille pyocyanique, et qu'il faut être prêt à le reconnaître sous les modifications qu'il peut éprouver dans ce nouveau milieu, et sous la diversité des symp- tômes qu'il y provoque. Les recherches que je viens d'exposer auront ajouté peut-être aux éléments de diagnostic de cette espèce microbienne. Elles conduiront sans doute à une autre conséquence. On trouve souvent encore dans les travaux de microbie la mention d'un bacille du pus vert. La spécificité, que cette dénomination implique, me paraît sujette à caution. Le phénomène qu'elle rappelle consiste en un vert fluorescent du produit sécrété. Ou le bacille en cause est une des races F du bacille pyocyanique, ce qu'on saura désormais reconnaître, et il n'est plus besoin d'un nom nouveau, ou c'est un des microbes fluorescents banaux dont on a multiplié les espèces en proportion des milieux divers 011 cette fonction banale trouve à s'exercer. Le nombre s'en réduira, et la spécificité au regard de chaque milieu tombera du même coup, quand on attachera moins d'importance aux caractères contingents de la forme, de l'aspect des colonies, de la liquéfaction de la gélatine, etc. Je me crois d'autant plus autorisé à faire ces réserves, qu'ayant trouvé tout récemment, dans le laboratoire de M. Du- claux, une culture du bacille du pus vert qui venait de chez M. llueppe, j'ai constaté que l'ensemencement de cette culture sur gélatine donnait une fluorescence verte sans mélange de bleu, mais que, sur g-élose-peptone g;lycérinée, elle donnait de la pyocyanine. \II Les conclusions de cette étude et de mes études précédentes sont les suivantes : i. Voyez Semaine médicale, 1890 : Ehlers, p. 211 ; Œltiuger, p. 383; Neumann. p. 386; et Soc. de biologie, 2G juillet i890, Gharrin. RACES DU BACILLE PVOCYANIQUE. 77 Le bacille pyocyaiiiqiie a deux fondions cliromogènes ' : A. La fonction pyocyanogène, la plus importauLc en tant que caractéristique de l'espèce, dépend : 1" du milieu. Par rapport au type de l'espèce le plus parfait : l'albumine est réfractaire à la production de pyocyanine ^ ; le bouillon est indifférent, étant aussi bien approprié à l'autre fonction ; la peptone est le milieu le plus favorable. 2° du microbe. Par rapport au milieu d'épreuve habituel, le bouillon, on distingue plusieurs races : une n'a que la fonc- tion pyocyanogène ; une autre race l'exerce concurremment avec la fonction iluorescigène; des races en sont dépourvues, mais elle reparaît pour ces dernières en milieu gélatine-pep- tone glycérinée; et d'un autre côté, parla culture en série du microbe dans le milieu réfractaire, elle est exaltée au point d'atteindre, par report dans le bouillon môme, à la pureté et à l'intensité d'effets d'ordinaire spéciales à la peptone. B. La fonction fluorescigène est commune au bacille pyocya- nique et à plusieurs microbes. L'albumine, le bouillon la favorisent. La peptone l'exclut. Par rapport aux milieux favorables, elle est également dans la dépendance de la race. Ainsi, en plus des questions de milieu, d'espèce, il faut faire acception de la question de race dans une espèce donnée. Ce n'est pas une notion nouvelle. J'ai rappelé que l'atténua- tion des virus l'a établie anciennement dans la science. Les faits que j'ai exposés ne font que la confirmer et l'illustrer, si j'ose ainsi parler, de la clarté qu'apportent des jeux de couleurs nette- ment perceptibles à la vue. Que l'on considère la fonction en microbie aussi bien sous le i. Je laisse ici de côté le troisième pigraont. Non que mes expériences nou- velles en aient infirmé l'existence. Mais elles n'en ont pas avancé l'étude. Ses rap- ports avec la pyocyanine doivent être approfondis. Je l'ai toujours retrouvé avec cette dernière, quand la fluorescence n'existait pas, par conséquent avec la race P dans tous les milieux; avec la race A, en p3ptone,en gélatine. 2. Je répéterai que l'albumine n'exclut pas la production de pyocyanine. Dans la longue série de mes cultures en albumine d'œuf, j'ai vu quelquefois survenir le pigment bleu, mais au bout d'un temps fort long. Je n'ai jamais employé dans ces passages que des cultures qui n'en contenaient pas trace. Or certains ensemen- cements sont espacés de trois semaines. 7,S ANNALES DE LlNSïlTUT PASTEUR. point de vue pathogène que sous le point de vue chromogène, le sens des constatations n'en sera pas affecté. On peut, par un rapprochement légitime, assimiler à une infection cette pro- pagation de la couleur bleue par un contage vivant. Inégale réceptivité des milieux, virulence variable des races, accrue en milieu réfractaire, tels sont les traits principaux de cette infec- tion bleue, et qui sont communs aux autres infections. Le résumé de cette étude tient dans cette formule générale : Les effets observés pour une espèce microbienne varient avec les milieux, et dans un milieu donné avec les races que comporte toute espèce. Note. — Le réactif gélose-peptone est rapidement préparé comme il suit. La gélose, finement hachée, est introduite à la dose de gr. 25 dans chaque tube à essai. On ajoute 5"^ de solution de peptone neutre à 2 «/o, S gouttes de glycérine. On doit avoir la précaution de maintenir les tubes quelque temps au bain-marie bouillant, avant de les soumettre à l'autoclave, pour éviter le brusque dégagement de l'air emprisonné dans la gélose, d'où peut résulter une projection, tout au moins une souillure du bouchon d'ouate. Ou stérilise ensuite à 120° pen- dant cinq minutes. Les tubes sont mis à refroidir horizontale- ment. CO\ri{ll{lTI(l\ A L ÉTIDE DES EAUX D ALGER PAR M. l^ÉRK, PHARMACIEN-MAJOR DE 2^ CLASSE. La lièvre typhoïde est endémique à Alger; chaque année, pendant les mois d'août, de septembre et d'octobre, elle revêt un caractère plus sévère par le nombre comme par la gravité des cas que l'on observe. Elle frappe la population militaire, d'une si ''grande réceptivité pour les maladies infectieuses, comme la population civile. Bien que les causes soient par ailleurs nombreuses qui per- mettent à Alger l'éclosion des maladies microbiennes et qui favorisent leur développement, je me suis demandé si la qualité des eaux alimentaires n'était pas l'un des facteurs essentiels de la constitution médicale de cette ville, si ces eaux ne seraient pas la cause première de l'alfection typhique. Je n'ai pas cru pouvoir, dans l'étude de cette question, me borner, comme on l'a fait souvent, à la recherche dans les eaux du bacille typhique ou en général des microbes d'origine sur- tout excrémentitielle; il ne me semble pas que le jugement à porter sur une eau potable soit une question que l'on puisse résou- dre sans sortir de son laboratoire. Sans doute, quand on trouve dans une eau suspecte le hacterlum coli commune en grand nombre, ou le bacille typhique, on peut prononcer contre cette eau une condamnation méritée; mais une eau oii on ne trouve pas de microbes suspects n'est pas par cela seul une bonue eau; ils peuvent avoir échappé parce qu'ils sont rares ou qu'ils n'existent pas dans l'échantillon étudié. Dans ces cas, l'examen de l'origine de l'eau, de son mode de captation, de sa canalisa- tion s'impose. C'est par examen que j'ai commencé, je vais en indiquer les résultats: je dirai ensuite comment j'ai cherché à éviter les causes d'erreur provenant de ce que les g-ermes sus- pects peuvent être rares dans l'échantillon soumis à l'expérience. 80 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. ORIGINE DÉS EAUX d'aLGER, LEUR MODE d'aLIMENTATION. CANALISATION. En principe, la ville d'Alger est alimenlée par des eaux de sources. Le graphique n° 1 indique les points d'origine de ces eaux, ainsi que le parcours de la canalisation. EchelJi larin dessa .-■'" 50'° Sources Canal de Birtrana Carta] duHanima Canaldel'Aiirz'Baadfa *Bi Mampe Valèe mk. lMedM'Kacel[\\<^U du Dejj ) ♦Hi (râkrit duHamma *Hî Quartier des chasseurs + Hs _ Bue deh [jl^erlè CanaJ duWernly ^T. Bue Mchelet + Zi Caserne d'Orléans *T.i Résen^oirdebSimâgoaue .Z, Fhubmohal-Ouèd '^ ^ Alimentation des eaux d'Alger. 1° Eaux de Hamma : captées par une belle galerie située en face du jardin d'essai H'. Altitude: 50°\ Le canal d'adduction, parallèle à la côte, longe un cimetière arabe et le champ de manœuvres. Elles desservent Mustapha-Jnférieur et la ville basse. 2° Eaux du Téleml}^ : point d'origine à Mustapha-Supé- rieur. Altitude 150™. Desservent Mustapha-Supérieur et la ville moyenne. 3° Eaux de l'Aïn-Z'boudja : elles sont fournies par un système de sources situées sur le plateau argilo-calcaire qui s'étend d'El- Biar à Ben-Aknoun. Altitude : 200 à 250°*. Chacune de ces sources va rejoindre une canalisation principale qui amène ces ÉTUDE DES EAUX D'ALGEll. SI eaux au Réservoir du Sahel et de là au Réservoir de la Synagogue Z^ Ces eaux prennent pendant l'hiver une large part à l'alinien- talion d'Alger. 4° Eaux de la IVulraria : leur canalisation est, en certain point, dominée par un cimetière arabe. S*' Enfui un aijueduc spécial amène à Diôpital du Dey les eaux de l'Oued M'kacel prises vers leurs sources. La tjuantité d'eau ainsi obtenue n'étant plus suffisante, la ville d'Alger exploite depuis quelques années une nappe d'eaux artésiennes, d'une profondeur de 32" à 56"', située à peu de dis- tance de l'Oued el Harrach, entre les stations de Maison-Carrée et du Gué de Constantine. Ces eaux, dites eaux de Dœiish, sont refoulées par deux machines élévatoires jusqu'au Réservoir de Koiiha^ d'où elles sont conduites à Alger par une canalisation tubulaire. Il n'en sera pas question dans cette étude, unique- ment réservée aux eaux de sources énumérées ci-dessus. Le graphique n°2, indiquant le débit des sources principales, Débit en me I OJ ^~ ^ lO O C^ 4 <^ S ^ ii ^ ©JkO -^irt ;o î^ Qcos^ zr Si-'^ oJKî -^ini to t>»ooci -1887 1888 1889 Fig. 2. est intéressant à plus d'un titre, mais principalement pour les notions qu'il nous fournit sur le mode d'alimentation de ces sources. Les débits du Hamma et celui du Télemlyy sont figurés par une courbe presque horizontale, ne subissant aucune influence saisonnière ; par leur constance, ils donnent ces eaux pour des eaux de profondeur, et partant pourdes eaux pures àleur origine. 6 82 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. II n'en est pas de même des eaux de l'Ain Z'boudja dont la courbe, à oscillations brusques et de grande étendue, montre un débit irréguiier, suivant avec fidélité l'alternance des saisons, très faible pendant la saison sèche, très élevé pendant l'époque pluvieuse : caractère principal des eaux de surface, alimentées par les eaux pluviales n'ayant subi à travers le sol qu'une filtra- tion rapide et iusuffisante. D'ores et déjà, on peut conclure que ces eaux ont une origine suspecte. 11 est vrai que la région au voisinag-e des sources est encore peu habitée, de sorte que le danger pourrait n'être aujourd'hui qu'hypothétique ; mais d'un moment à l'autre il pourrait devenir réel. Les Algériens assurent que leurs eaux se troublent parfois pendant la saison des pluies. Personnellement, j'ai pu observer ce fait pour les eaux qui alimentent le Dey et pour celles de la Birtraria, de sorte que les sources du Hamma et du Télemly seraient seules des eaux de profondeur. Pour toutes ces sources, la canalisation est la même, vicieuse en soi et présentant de nombreuses défectuosités '. Les canaux d'adduction sont en maçonnerie, souterrains dans presque tout leur parcours, pour la plupart de construction ancienne, et il est peu aisé de se rendre compte du degré d'étanchéité qu'ils possèdent encore. Ils sont munis de regards fermés par des pierres plates qui laissent s'infiltrer dans le canal ce qu'on dépose à leur surface, par exemple les excréments dont on les voit souvent couvertes. Quant aux réservoirs, celui delà Synagogue est fissuré à son faîte, et sur ce faîte repose la place Randon habi- tée par des marchands indigènes, d'une malpropreté repoussante. L'hygiéniste rigoureux trouverait déjà des raisons suffisantes de condamnation, mais nous devons conlirmer ce jugement pré- liminaire par quelques mesures précises qui prouvent le fait de la contamination de l'eau pendant son parcours. Chlore. — Une eau bien captée doit avoir à toute distance de son origine une composition constante, sauf les changements 1. Les défectuosités delà canalisatioa furent constatées au mois d'octobre 1889 par une commission chargée de procéder « à l'analyse bactériologique des eaux d'Alger «; elles furent signalées au conseil déparlenienlal dliygièue par M. le W Trabut, rapporteur. Celte commission, composée de MM.Trabut et Soulié, profes- seurs à l'École de médecine, Langlois, chimiste expert, et Péré, pharmacien major, ne put faire la preuve bactériologi(jue d'une pollution. ETUDE DES EAUX D'AEGEK. 83 provenant des dépots qu'elle laisse se former le long des parois qu'elle: baigne. En particulier elle doit renfermer une proportion constante de chlore, que Ton peut choisir comme terrain d'étude, à la fois parce que sa détermination au moyen du nitrate d'argent, par le procédé de Mohr, est facile et rapide, et aussi parce que les chlorures sont au nombre des éléments que toute agglomé- ration humaine laisse constamment s'écouler dans le sol. L'aug- mentation de la proportion de chlore le long de la canalisation est donc un argument en faveur de la contamination. Voici les résultats trouvés pour les eaux d'Alger qui sont, comme on va le voir, très riches en chlore au départ, à cause du titre élevé de leur minéralisation Ain Z'boHdja. On a recueilli les eaux de l'Aïn Z'boudja au rnème moment à la caserne d'Orléans Z', à la Rampe Rovigo et au Réservoir de la Synagogue Z-; elles ont donné pour un litre : Caserne d'Orléans Z' 82 milligr. de chlore. Rampe Rovigo 94 — Réservoir de la Synagogue 99 — Hamma. Les eaux du Hamma,prises le même jour à la source et en un point de la canalisation distant de 3 km. environ, ont donné les résultats suivants : llamma, source. H' 83,6 milligr. de chlore. d" au point IP 92,3 — Ainsi des inhltrations se produisent dans la canalisation, qui augmentent d'une manière très sensible la proportion de chlore dissous. Matière organiqle. — On a évalué la quantité de matière organique par la proportion d'oxygène qu'elle emprunte dans des conditions identiques à une solution de permanganate de potasse. Le procédé employé est celui qui a été recommandé par le Comité d'hygiène, et qui est pratiqué au laboratoire de Mont- 1. Résidu de l'évaporation desséché à 120», pour un litre : Oued .M'kacel(Hôp.du Dev) 0"(iSo Eaux de la Birtraria. Hamma " . o, «40 Chlore :20(j milligr Am Z-'boudja 0, 523 Ac. sulfuriqiie .... 16S — ' Télemiy 0, îieô Chaux ;20,i — Birtraria I, 000 Magnésie 60 — 84 .ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. souris. Voici comment on l'appliquait : 200'" d'eau étaient addi- tionnés de G*"'" d'une solution à 4 de bicarbonate de soude pur, et de lO'"" d'une solution de permanganate titrée, représentant par litre 160 milligrammes d'oxygène, soit 0,16 milligr. par cen- timètre cube. On chauffait progressivement et on maintenait l'ébullition pendant dix minutes. Après refroidissement on ajoutait 2" d'acide sulfurique pur, puis i'"" d'une solution acide de sulfate double de fer et d'ammoniaque. Lorsque la liqueur était devenue transparente, on versait goutte à goutte avec une burette la solution de permanganate jusqu'à production d'une teinte rose sensible : soit 7<" le volume employé. En même temps on opérait de même sur 400*"'" d'eau, en réglant les deux foyers de chaleur de manière à obtenir l'ébulli- tion au même moment dans les deux: ballons; soit (n -\- af'^ le volume de la solution de caméléon nécessaire pour obtenir la même coloration rose : «'"'" représente le volume de permanga- nate réduit par 200'"" d'eau, et oa X 0.16 le poids, en milli- grammes, d'oxygène emprunté par la matière organique que renferme un litre de cette eau. Or, l'application de cette méthode à l'étude des eaux d"\lger montre que l'échantillon, pris en quelque point que ce soit, exige pour un litre moins de 1 milligramme d'oxygène, c'est-à-dire qu'un examen superficiel pourrait donner ces eaux comme très pures. Mais, en comparant les résultats obtenus en deux points différents, on voit que l'eau du Hamma emprunte à la solution de caméléon : Prise à la sourcp 0,12 milligr. d'oxygène. au point H^ 0,20 — Il y a donc, en général, dans les eaux d'Alger, très peu de matière organique attaquable par les réactifs suivant le procédé employé, mais cette quantité augmente lorsqu'on s'éloigne de la source : et ce fait confirme le renseignement que le dosage du chlore nous a déjà fourni. On arrive à la même conclusion en étudiant la rapidité avec laquelle l'eau perd son oxygène sous l'influence des microbes qui s'y développent, lorsqu'elle est conservée au laboratoire dans des conditions déterminées. J'ai constaté que l'eau puisée en H^ perdait ainsi, dans le même temps, deux fois plus d'oxygène à peu près que l'eau puisée à la source. Et on sait que, en ÉTUDE DES EAUX DALGER. 85 général, celle perle d'oxygène est d'aulanl plus rapide que l'eau renferme plus de malière organique. Mais les nombres ainsi obtenus ne peuvent pas, à cause de leur manque de précision, èlre mis au même plan que ceux relalifs au dosage du chlore ou de la malière organique. Je me borne à remarquer que toutes ces mesures s'accordent à démontrer une infiltration organique le long de la canali- sation. ]I RECHERCHES BACTÉRIOLOGIQUES Les recherches qui précèdent m'ayant amené à conclure à une contamination des eaux le long de la canalisation, j'ai essayé de pousser la démonstration plus loin en recherchant dans ces eaux les organismes d'origine fécale les mieux connus, à savoir le bacterium coli commune et le bacille tijphique. Les procédés imaginés pour la recherche de ces deux microbes dans les eaux ont rendu de grands services. Malheureusement, ils ne permettent d'agir que sur une faible quantité de liquide. Même avec celui de M. Vincent, c'est de l'étude de quelques centimètres cubes de liquide qu'il faut conclure à l'ensemble d'une canalisation. Quand il y a beaucoup de microbes suspects ou dangereux, on peut les découvrir, et même, ce qui est avan- tageux parfois, les dénombrer assez exactement, grâce au frac- tionnement qui est dans les conditions de ces diverses méthodes. Par contre, quand ces microbes sont rares ou irrégulièrement répartis, ils peuvent échapper à l'examen. J'ai donc pensé qu'à côté de ces méthodes excellentes, et en profitant de ce qu'elles nous ont appris, on pouvait en essayer une autre, qui permît d'opérer sur un volume de liquide beaucoup plus considérable, en subordonnant, en ce qui regarde les microbes, la question de quantité à la question de qualité. ^Nombreux, en effet, sont les cas dans lesquels il s'agit moins d'apprécier dans quelles proportions des contaminations fécales sont faites, que de savoir si elles sont possibles, et oii la cons- tatation dans un litre d'eau de quelques microbes ayant celte origine aura, au point de vue pratique, une importance capitale. Ces microbes, quand ils se chill'rent par quelques unités, risque- 86 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. raient fort de passer inaperçus avec les méthodes en usage; on les mettra au contraire facilement en évidence par le procédé que je propose, et que j'ai déjà appliqué avec fruit à un grand nombre d'essais. Voici le principe sur lequel il s'appuie. L'eau suspecte est transformée en un terrainde culture suffi- samment nutritif, dans lequel la présence d'une proportion déter- minée d'acide phénique; sans empêcher la multiplication des germes du Bacter'mm coli commune et du Bacille ti/phiqiie, met obstacle à celle des espèces étrangères, ainsi que l'a démontré la pratique des procédés usuels. MODE OPÉRATOIRE. — Dans uu récipicut jaugé de 1 litre, stérilisé (matras ou ballon), on introduit 100''° de bouillon de bœuf normal ', neutre et stérile; oO" d'une solution de peptone pure à 10 %• également neutre et stérilisée; et 600 à 700''' de l'eau à analyser. On ajoute alors 20"'^, exactement mesurés, d'une solution d'acide phénique pur à o °/o, et on emplit jusqu'au trait de jauge avec l'eau suspecte. Le liquide obtenu, que j'appellerai liquide A, contient donc par litre un gramme d'acide phénique et 830'''' d'eau suspecte. ^ On le répartit en dix vases stérilisés, fioles, ballons ou ma.- tras, munis de leurs bouchons d'ouate, et on le porte à la tempé- rature moyenne de 34°. Il ne faut pas dépasser 36° ; on risquerait, par l'application un peu soutenue d'uue température plus élevée, d'atteindre trop vivement les microbes que l'on recherche, et de stériliser le terrain. La température de 32° à 36° est très convenable. Un trouble se produit dans le cas d'une eau polluée par les espèces susdites, non pas à heure fixe, mais d'autant plus vite que la pollution est plus forte, et que la température s'est main- tenue plus élevée dans les limites assignées. On pourra déjà observer ce trouble vers la 12« heure, généralement entre la 15« et la 20« heure, mais seulement vers la 30^ heure si la pollu- tion est réduite à des traces : circonstance qui ne se présentera que rarement, sans doute, mais que l'on peut réaliser par l'ex- périence. 1. Par parties égales rie viande de bœuf et d'eau. ETi:i)E DES EAUX D'ALiîKIL 87 Dès que le trouhlo esl bien évideul, on ensemence le liquide A à l'aide d'un fil de plaline llamhé et recourbé en boucle, d'une part dans un tube de bouillon normal qui pourrait déjà donner une culture pure de l'un des organismes que l'on recherche, et d'autre part sur un nouveau liquide stérilisé, renfermant comme le l''''un gramme d'acide phénique, o g^rammes de peptone, et 100'"' de bouillon normal par litre, et réparti dans des tubes à essai. J'ensemence deux de ces tubes, et les expuse pendant G heures à la température moyenne de 34". A ce moment, que leur con- tenu soit trouble ou limpide, on l'ensemence parle même moyen que précédemment dans deux autres tubes où les organismes subissent leur 3^ passage en liquide phénique dans les mêmes conditions de température. On attend cette fois que le trouble se produise ; l'ensemencement de ce dernier liquide sur bouillon normal donne, après quelques heures d'étuve, une culture pure du Bactcrinm coli commune, du bacille d'Eberth, ou un mélang'e des deux espèces, comme on peutle vérifier par culture sur plaque de gélatine. Je me suis assuré que les deux microbes supporteraient encore deux nouveaux passages sur liquide phénique, espacés de <3 heures, comme il en est pour le 2<' et le 3'' passages ; on pourrait donc pratiquer ces passages nouveaux en vue de séparer quelques espèces étrangères ayant résisté au traitement; je n'en ai pas rencontré dans les eaux alimentaires d'Alger. L'application de cette technique à l'examen d'échantillons d'eaux polluées naturellement ou artificiellement a montré que les 10 vases remplis du liquide A se troublent tous en général, et l'observation de leur culture montre partoutlemême organisme. Il suffirait donc le plus souvent de préparer et de traiter 100'" de liquide A, correspondant à 83"' d'eau suspecte, sauf à répéter l'expérience sur un litre en cas de résultat négatif, et si l'examen de la canalisation, les recherches chimiques, ou toute autre circonstance faisaient soupçonner une pollution. J'ai réalisé ce cas d'une eau ne renfermant que des germes très rares, en diluant au millième un échantillon ensemencé avec uneculture mixte de Bacteriumcoli commune et de bacille typhique, et qui, pour un centimètre cube, donnait sept colonies pouvant se rapporter à ces deux espèces. L'eau diluée renfermait donc 88 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. environ sept germes par litre. Sur les dix matras contenant le liquide A, deux se sont troublés vers la 30*^ heure, trois autres avant la 36*^ heure, les cinq derniers restaient limpides. Les espèces qui résistent au l^"" passage en terrain phéniqué sont celles qui ont été signalées par M. Vincent. Comme cet observateur, j'ai vu le microbe d'Eberth affecter la forme en diplocoque mobile, forme passagère, due à Faction du milieu phéniqué; mais il récupère ses attributs morphologiques habituels par un ensemencement ou une série de 3 ensemencements sur le bouillon normal. Le Bacterium coli commune trouble le liquide, le plus souvent, avant le Bacille ti/phique, de sorte que si les deux espèces se trouvaient dans le même milieu, on pourrait craindre a priori que le premier se présentât seul après le 3« passage. L'expérience directe n'a pas justifié cette crainte : la méthode des plaques a montré que les deux microbes vivaient côte à côte dans le bouillon normal, après le premier et après le troisième passage en terrain phéniqué. En possession de ce procédé, j'ai fait sur les eaux d'Alger les expériences suivantes : 4 octobre 1890. — L'eau, de l'Oued-M'kacel , prise au laboratoire de chimie de l'hôpital du Dey, est transformée en liquide A. Un litre de ce liquide, divisé en dix fioles stérilisées, est exposé à la température moyenne de 34°; il s'est troublé dans 3 récipients après la 12*^ heure, et dans tous les autres vers la 45' heure. 5 octobre 1890. — L'eau de Birtraria, prise au point B', et l'eau de l'Aïn-Z'boudja, prise en Z^, Za, Z3 et à laBampe Bovigo, sont traitées comme ci-dessus, chaque échantillon fournissant 200'^'^ de liquide A répartis en deux fioles. Le liquide est partout limpide à la 12" heure, et trouble vers la lo*' heure dans tous les récipients. 6 octobre 1890. — Je procède de même pour Teau du llamma recueillie àla source, avec laquelle je prépare un litre de liquide A, réparti entre dix fioles; et aussi pour la même eau prise en 11-, IP, au milieu de la ville, ainsi que dans la rue de Tanger (llamma? ïélemly ?) ; je traite de même l'eau de Télemly prise ETUDE DES EAUX D'ALGER. 89 en T' et ï^ chacun de ces six échantillons fournissant lOU''' de liquide A, Entre la lo" et la 18^ heure, le contenu des six flacons s'est troublé; le liquide est encore limpide au 4" jour dans les 10 autres vases, qui renferment Teau du llamma puisée à la source et traitée par la même méthode. d octobre 181)0. — J'ai recueilli l'eau du Hamma à la source même et au point IF. Les deux échantillons ont été d'une part transformés en liquide A, d'autre part additionnés d'une quantité égale de peptone à o/lOOO, et de bouillon normal à 10 0/0, mais sans addition d'acide phénique. Les 4 flacons étant exposés à la température moyenne de 34'\ le contenu de l'un d'eux est seul limpide après 18 heures : c'est le liquide A provenant de l'eau puisée à la source. J'ai alors ajouté aux deux flacons dont le contenu n'est pas phénique, la proportion d'acide phénique nécessaire pour trans- former ce contenu en liquide A. Après 18 nouvelles heures d'étuve, l'un des flacons troubles est redevenu limpide et présente un abondant dépôt d'orga- nismes : c'est celui qui renferme l'eau puisée à la source. Le trouble qu'on y remarquait tout d'abord est donc dû à d'autres espèces que le Bacterium coli commune et le bacille typhique. Au contraire, le contenu des deux autres flacons remplis au point H^ est trouble, bien que dans l'un d'eux se soit formé un sédiment considérable d'organismes ; c'est qu'ils renferment au moins une espèce suspecte, La limpidité des deux premiers persiste encore au 4® jour, ainsi que le trouble des deux autres. 13 octobre 1890. — Enfin les douze échantillons pris sur la canalisation, dont il a été question dans les expériences précé- dentes sont transformés en liquide A et mis ensemble à l'étuve : ils se troublent delà 14" à la 20** heure. Sitôt que le contenu d'un récipient est troublé, on l'ensemence à l'anse de platine sur un liquide phénique, où l'organisme qui a produit ce trouble subit, d'après les prescriptions de la méthode, deux passages espacés de six heures. Le liquide provenant du dernier passage est ensemencé sur bouillon normal. On a ainsi obtenu douze cultures sur bouillon, à l'aide desquelles on a fait les réactions sur gélatine en piqûre et en 00 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. plaque, et sur pomme de terre. Or, l'étude des réactions sur ces divers terrains, ainsi que l'observation au microscope des caractères morphologiques de l'organisme, m'a permis de diagnostiquer le BactêrUim coli commune, reconnaissable à tous ses caractères lorsque je l'ai comparé au Bacteriam coli retiré de mon intestin. Sur trois plaques, à côté des colonies appartenant au bacille du colon, se sont développées plus lentement des colonies dun autre aspect, minces et transparentes, nacrées, bleutées, ne présentant au centre qu'une très faible élévation. On les a recueillies, ensemencées sur bouillon, et de là sur les autres terrains. Le bouillon, avant 24 heures, a présenté un trouble qui s'est peu accentué; il ne s'est formé, après plusieurs jours, qu'un faible dépôt. Les cultures sur gélatine ne dégagent aucune odeur, et ne sontjamais liquéfiées ; sur plaque, les colonies apparaissent au S*' jour et présentent les caractères indiqués ci-dessus. L'ensemencement sur pomme de terre a provoqué la formation d'une culture visible au 2^ jour; elle ne présente aucune épaisseur, est incolore, humide et brillante, glacée. Le microscope montre dans le bouillon et dans cette culture sur pomme de terre un bacille présentant des dimensions inégales, très mobile dans le bouillon ; les individus de première grandeur, très rares, animés d'un mouvement sinueux ; les autres plus nombreux et plus petits, d'un mouvement oscillatoire très vif et d'un mou- vement de translation rapide qui leur fait traverser tout le champ; ce bacille est décoloré par la méthode de Gram. Ce sont bien les attributs du bacille typhique tels que je les ai observés sur deux échantillons d'origine authentique cultivés parallèlement, tels aussi qu'ils lui sont assignés par les obser- vateurs, et qui suffisent, pour assurer son diagnostic, à qui en a fait une étude patiente. Les plaques d'où on a pu isoler le bacille typhique provien- nent de l'eau de l'Ain Z'Boudja ( réserv^oir de la Synagogue et Rampe Rovigo) et de l'eau de la Birlraria prise en B'. CONGLUSIOxNS Il résulte des considérations développées en premier lieu que parmi les eaux de sources étudiées, celles du llamma et du ÉTUDE DES EAUX U ALdEU. 01 Télcmly sont seules des eaux de profondeur, et que sur tous les points, la canalisation, vicieuse par sa nature mrme, présente encore des défectuosités qui montrent comme possible et probable une pollution par les matières excrémentitielles. Les expériences cbimiques indiquées ensuite ont fourni des résultats qui permettent d'assurer l'existence d'infiltrations du dehors dans l'intérieur de la canalisation. Enfin, les recherches microbiques entreprises pur le procédé que j'ai décrit ont permis d'isoler de toutes ces eaux le BacW- rliim coli coiiimuue. hôte habituel des matières fécales et des eaux polluées. L'ensemble de ces notions démontre d'une manière évidente que les eaux de sources d'Algei- sont entachées de pollution par les matières fécales. Enfin , on a pu isoler des eaux de la Birtraria et de l'Aïii- Z'Boudja le bacille typhique, à la date du 13 octobre 18110; et ainsi se trouve éclairée, dans une de ses grandes lignes, l'étio- logie de la fièvre typhoïde à Alger. Quel est le degré d'intensité de cette pollution? Il ne m'a pas paru nécessaire de le rechercher. En effet, pour l'hygiéniste, une eau potable ne doit renfermer aucun germe nocif ou suspect ; par contre l'eau est polluée quand elle renferme ces germes, si minime qu'en soit le nombre, et toute pollution, faible ou forte, entraîne condamnation. Suivant cette doctrine, les eaux d'Alger doivent être condamnées. Je me fais un devoir de remercier ici nos collègues et amis, MM. Cuminet et Bodard, pour l'empressement qu'ils ont mis à m'offrir et à me prêter leur précieux concours. ummm m m mmm^ m ik mtrificâtio^ (4" mémoire). Par m. s. WINOGRADSKY. SUR UN MILIEU SOLIDK APPROPRIE A LEUR CULTURE. En décrivant, dans mon premier mémoire sur la nilrificaLion, la voie par laquelle je suis parvenu à découvrir un organisme nitriiicateiir, j'ai insisté sur les difficultés qu'on rencontre, quand on veut le cultiver à l'état de parfaite pureté. La culture dans une solution de sels inorganiques ne lui assure qu'une très grande prépondérance, mais n'exclut pas les quelques autres formes de bactéries banales, dont les germes, quelque nombreux que soient les ensemencements successifs, passent avec lui de culture en culture, et atteignent à chaque fois un certain degré de développement. Pour m'en débarrasser, j'ai utilisé, comme se rappellent les lecteurs des Annales, la manière différente dont se comportent sur la gélatine nutritive ces formes étrangères d'un côté, les nitrobactéries ' d'un autre. Ces dernières n'y poussent pas, tandis que les premières révèlent tout de suite leur présence par la formation de colonies. En étalant sur la gélatine le dépôt magnésique ou calcique des cultures (contenant surtout l'organisme cherché), je le reprenais au bout d'un temps suffisant aux endroits libres de toutes colonies, et je l'utilisais comme semence; de cette manière j'ai réussi une première fois à avoir des cultures nitrifiées, exemptes de tout germe se déve- loppant sur la gélatine au bouillon peptonisé. ■1. C'est ainsi que nous désignerons le petit groupa d'organismes, dont l'oxyda- tion de l'azote ammoniacal est la fonction. M'étant assuré que, pris dans des localités éloignées, ils présentent des différences morphologiques asse:; marquées, je préfèrd en parler non comme d'an ferment unique, mais comme d'un groupe physioluyique. ORGAMSiMi:s 1)K LA NITIUFICATION. 93 J'ai sJo-nalé ce résultat, en m'abstenant de recommander la méthode comme étant toujours d'une application sure. Elle devait encore faire ses preuves. Depuis, j'ai eu maintes fois l'occasion d'entreprendre la sépa- ration des nitrobactéries de diverses terres, et j'ai été amené par des échecs à reconnaître que cette méthode ne suftit pas dans la majorité des cas. En voici la raison. Il est très facile d'éliminer par ce procédé tous les organismes qui croissent rapidement sur la gélatine, et dont les colonies se montrent au 2" ou Séjour. J'y ai réussi presque toujours d'un coup. Mais il n'en est pas ainsi avec d'autres espèces à végétation pénible sur le même milieu, et qui sont souvent présentes dans le sol ; j'ai eu l'occasion de m'en assurer. Leurs colonies n'apparaissent que du 8" au 10' jour, et elles restent longtemps très petites. 11 arrive ainsi, par exemple, qu'on pique la gélatine à un endroit complètement exempt de colonies, et qu'en examinant ensuite la piqûre et ses alentours on les trouve remplis de très petites colonies. Il n'est guère dou- teux alors que la semence puisée n'a pas été pure. On n'a aucune chance de remédier à cet inconvénient, en reculant le moment de la prise de semence, car au bout de dix jours environ la surface de la gélatine n'en fournit plus d'efficace. En somme, il faut le concours d'un heureux hasard, j'entends l'absence de ces mi- crobes à végétation lente, pour réussir à isoler complètement une nitrobactérie par ce procédé. Il permet pourtant de pousser très loin, en peu de temps, la purification d'une culture impure. Par malheur, il y a encore à compter, dans cette question de la séparation des nitrobactéries, avec une difficulté autrement sérieuse. Quelles g-aranties de la pureté d'une culture de ces organismes faut-il exiger? Autrefois on considérait un liquide comme stérile, s'il ne donnait pas de végétation sur la gélatine ; l'ensemencement sur ce milieu était tenu pour le mode de con- trôle le plus décisif. Il a été démontré maintenant qu'un liquide peut contenir des quantités énormes de nitrobactéries et laisser les g-élatines stériles. Mais pour les autres qui l'accompagnent comme impuretés, on était autorisé, d'après les opinions cou- rantes, à considérer toujours l'épreuve de la gélatine comme valable. Le phénomène de nitrificatiou et la stérilité sur la gélatine nutritive sont devenus ainsi tout naturellement les caractères d'une culture pure de nitrobactéries. Indépendamment <.)4 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. l'un de l'autre, M. et M™^ Frankland ' et moi, nous les ayons adoptés. Pour ma part, j'avoue pourtant ne les avoir avancés que pro- visoirement, et sans être convaincu de leur infaillibilité. Stric- tement parlant, l'épreuve de l'ensemencement sur la gélatine ne suffit pas à elle seule, car refuser d'y croître nest pas un pri- vilège exclusif des nilrobactéries. Tel peut être le cas quelquefois, pour un mélange accidentel de microbes introduits avec une terre quelconque dans les cultures, mais le critérium n'est pas absolu \ Il se peut ainsi qu'en croyant avoir réussi, on ne par- vienne qu'à éliminer tout ce qui croit sur la gélatine, sans débarrasser les cultures de quelques espèces étrangères, réfrac- taires, comme les nitrobacléries, à ce genre de culture, mais qui auraient réapparu si elles avaient été ensemencées dans le bouillon ou quelque autre liquide nutritifs Pour décider de la pureté ou non pureté, une étude micros- copique soigneuse avec l'emploi de diverses méthodes de colo- ration peut certainement venir en aide. Avec une connaissance parfaite des formes de la nitrobactérie qu'on cherche à isolei. et en laissant de côté toutes les idées de variation, on ne recon- naîtra comme pure qu'une culture dont l'homogénéité est abso- lue, mais non sans réserve encore, car les germes étrangers, s'il n'y en a que très peu, échappent facilement, comme on le sait, à l'analyse microscopique la plus consciencieuse. On pourrait bien ne pas pousser plus loin et se désintéresser de ces quelques germes, dont l'influence sur la nitrificalion est bien sûrement nulle, s'il ne s'agissait que de ce phénomène. Il faudrait renoncer alors à l'étude de plusieurs autres questions : J)our n'en citer qu'une, à celle de l'action des nitrobactéries sur les corps azotés autres que les sels ammoniacaux. Je n'ai pas besoin d'insister pour montrer qu'il ne serait guère raisonnable de l'entreprendre sans avoir toute garantie de la pureté absolue des cultures. 1. Le phénomène de nitrilicalioa et son ferment spéclûqne. Philos. Transactions uf. the R. Soc. of London, vol. 181 (1890). i. J'ai vu l)ien d'autres microbes, comme ceux, par exemple, des sources sulfu- reuses et ferrugiueuses, pour lesquelles ce milieu est non seulement défavorable, mais même mortel. ;>. C'est là, peut-être, qu'il faut clierclier l'explication de quelques observations de 31. et ftl""^ Frankland, exposées dans l'annexe de leur mémoire cité. UllGAiMSxMES I)K LA MTKIFICATION. <.)3 11 existe encore une méthode générale pour la séparation ik'S microbes qui s'imposait dans ce cas, où la gélatine refusait le service. C'est la méthode dite de dilution. Aussi n'a-t-on pas manqué de l'essayer. C'est M. Percy Frankland et M°"^ Fran- kland ' qui s'en sont servi avec le plus de persévérance et le plus de résultat. Leurs cjcprriences de dilution ont demandé deux ans, et ce n'est qu'au bout de ce temps qu'une seule culture de leurs longues séries s'est montrée comme « pure », c'est-à-dire qu'elle nitrifiait, laissait la gélatine au bouillon-peptone stérile, et, je le suppose, se montrait au microscope comme sensible- ment homogène. M. Warington ^ a aussi employé cette méthode sans pouvoir épurer ses cultures à ce point. Moi, je l'ai essayée pendant l'hiver de 1889-90. J'ai fait trois séries d'expériences (en tout 50 ensemencements) qui ont complètement manqué leur but. Ou il n'y avait aucune nitrification, ou les cultures nitrifiaient, mais leur impureté n'était rien moins que douteuse. J'ai bientôt définitivement abandonné la méthode, comme ne valant rien dans ce cas, et je persiste dans mon opinion. Elle prend énormé- ment de temps et le hasard, qui y est tout, n'aide que trop mal nos elTorts. Rendant tout hommage à la patience des auteurs cités, je ne crois pas que leur exemple inspire à quelqu'un, qui voudrait isoler le ferment nitrique de quelque terre, le désir de le faire par dilution ^ On comprendra, après ce qui a été dit, que la nécessité de chercher une méthode plus sûre s'imposait. Recourir aux milieux gélatinisants, et en chercher un qui soit apte à nourrir ces organismes, était évidemment le chemin qui promettait le plus. Ce milieu trouvé et ceux-ci y formant des colonies facile- ment reconnaissables, le problème aurait fait un grand pas vers sa solution, à une condition pourtant de plus, c'est que ce milieu soit en même temps absolument défavorable aux autres microbes; autrement, à cause de la lenteur extraordinaire de l'accroissement des nitrobactéries^ il serait, dans la plupart des cas, envahi et altéré avant que celles-ci eussent le temps d'atteindre un certain degré de développement. 1 . Loc. cil. 2. Chcm. Xcws, vol. LXI, n" 1S62. 3. L'histoire morphologique de ces organismes nous expliquera pounjuoi celte méthode aussi refuse le service. 96 ANNALES DE LLNSTITUT PASTEUR. J'avais déjà essayé anlérieurement, comme milieux de cultures, des solutions salines gélatinisées par la gélatine ou la gélose. Je renouvelai ces essais. Ayant maintenant plus d'expé- rience dans la culture des nitrobactéries, j'espérais pouvoir mieux aboutir. La solution suivante fat gélatinisée par 10 ^/oàe gélatine ou par 1 "/o de gélose : Phosphate de potasse 0. 1 ■ Sulfate de magnésie 0. 03 Chlorure de calcium trace Carbonate de soude 0. 5 Eau distillée 100 La gelée étant prête et stérilisée, on y incorporait quelques centimètres cubes d'une solution contenant : Sulfate d'ammoniaque 0. 2 Je savais que cette solution était favorable aux nitroorga- nismes. En la gélatinisant, surtout par 1 % de gélose, on pou- vait supposer qu'elle resterait telle pour eux, sans devenir sensi- blement nutritive pour d'autres. Les expériences de culture sur ces deux milieux n'eurent aucun résultat. J'ai dû bientôt définitivement rejeter l'usage de la gélatine : ensemencées par une goutte d'une culture nitrifiée impure, les plaques se liquéfiaient très rapidement, plus rapi- dement même que la gélatine au bouillon-peptone ayant reçu la même semence '. L'ensemencement de la gélose s'effectuait en étendant une goutte du liquide sur toute la surface de la plaque, ou en stries. Les végétations apparaissaient bientôt comme des taches diffuses, mal circonscrites, et envahissaient au bout de dix jours toute la surface de la plaque, rendant impossible l'opération d'isolement de la nitrobactérie, si même elle avait poussé. Mais je n'y ai jamais rien trouvé de ressemblant aux deux nitrobactéries que je cherchais à isoler par ce moyen, de même que je n'ai jamais réussi à constater dans ce milieu la présence de nitrites ou de nitrates. Quelques expériences ont pourtant duré 18 jours. Tout cela r\'encourageait pas à continuer ces essais. 1. Sur cette dernière je ne voyais les liquéfactions apparaître qu'au o" jour autour de grandes colonies assez rares, tandis que sur l'autre elle commençait, après i24 heures déjà, au voisinage de toutes petites colonies. 1 « I I OlifiANISMES DE LA MTIIIFICATION. 97 Je me tivuivai donc coiiduil mit' lois di- plus, dans mos icclierchHs sur la iiili-ilicalioM, à é\iler d'une ni.iriièrc absolui; loute subslance organique, llenonçant à regret aux substances gélatinisanles animales et végétales, dont remj)loi est si commode, j eus recours à une substance gélatinisante d'origine minérale. Le choix n'en est pas grand : entre l'hydrate d'alu- mine et celui de silice, je choisis le dernier. On connaît la préparation de la solution aqueuse d'acide sili- cique, d'après la méthode de Graham ', capable de se gélatiniser très facilement sous l'action de toute sorte de substances, et que M. W. Kuhnc a proposée ^ pour faire des terrains de cul- ture. En l'additionnant en certaines proportions d'une solution de sels minéraux, je me composais une gelée où toutes les nitrobactéries que je cultive ne tardèrent pas à se développer. Voici quelques détails sur la préparation et la composition de celle gélatine minérale. — milieu qui répond à toutes les exigences que nous avons posées plus haut. Le verre soluble qu'on trouve en vente est g'énéralement d'une consistance épaisse, presque sirupeuse; on l'étend alors de trois fois son volume d'eau. Cent centimètres cubes de ce liquide sont versés en agitant dans 50"" d'acide chlorhydrique étendu, et le mélange mis dans un dialyseur quelconque ^ Au bout de trois jours, en laissant le dialyseur le premier jour dans l'eau courante, le reste du temps dans l'eau distillée, souvent renouvelée, la solution est prête pour l'usage. On le reconnaît à ce qu'elle ne donne aucun trouble avec le nitrate d'argent. Elle peut alors être stérilisée par ébullition et con- servée dans un ballon bouché avec du coton ou du liège. Quant à la solution de sels minéraux à faire gélatiniser, je l'emploie de préférence ainsi dosée : Sulfate d'ammoniaque 0. 4 Sulfate de magnésie 0. 05 Phosphate de potasse 0. 1 Chlorure de calcium trace Carbonate de sodium 0. 6 à. 0. 9 Eau distillée 100 t. Graham-Otto, Lehrbnrh d. Chemie, t. II, p. 963, 1881. 2. L'acide silic,i(iue comme milieu nutritif pour les organismes. Zeitschr. f. Biol., t. IX, p. rrA. '.'>. 11 est inutile d'employer une solution dosée de silicate. Tout ce qu'il faut c'est de soumettre à la dialyse un liquide avec excès d'acide, et suffisamment dilué pour ne pas s'exposer au désagrément de le voir se gélatiniser S{)ontanément dans le dialyseur. 7 98 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. Les sulfates avec le chlorure d'un côlé. le phosphate et car- bonate d'un autre sont dissous séparément et les deux solutions stérilisées à part; on les mélange après refroidissement. Pour les cultures, je me servais des boîtes en verre bien connues que je choisissais petites (5 c. de diamètre) et de verre mince. L'arrangement des cultures se fait comme il suit : On commence par concentrer la solution silicique en l'éva- porant dans un petit ballon, jusqu'à ce qu'elle soit réduite à la moitié de son volume. Avant que le liquide ait atteint ce degré de concentration, on ralentit l'évaporation et on fait quelques essais successifs de son pouvoir gélatinisant. Pour cela, on prend sur un verre de montre 2 ou 3 gouttes du liquide et on y ajoute une goutte de solution saline : la tendance à gélatiniser doit se manifester au bout de 5 minutes ; au bout de 10 à lo, la gelée doit être si plastique qu'une empreinte faite sur sa surface ne s'efface plus. Aussitôt ce degré atteint, il n'est pas bon de pousser la coacentration plus loin, car alors la gelée ne sera pas pure, mais remplie de grains et d'écaillés d'acide silicique inso- luble. On distribue ensuite la solution silicique au moyen d'une mince pipette dans les boites et on la gélatinise, en y faisant couler la solution de sel; selon le degré de solidité qu'on veut atteindre, on en prend la moitié ou le tiers du volume de la solution silicique, et on n'oublie pas de bien mélanger les deux liquides. Au bout de quelques minutes une faible opalescence dénote la gélification. Si on veut répartir la semence dans la plaque, on a le temps de le faire immédiatement après avoir mélangé les deux liquides. Pour ensemencer par stries, on attend que la coagulation soit complète, soit quinze minutes. Quelquefois je remplaçais, dans ma solution de sels, le car- bonate alcalin, dont l'emploi présente quelque inconvénient, par le carbonate de magnésie. La limpidité de la gelée est alors naturellement perdue et sa transparence diminuée, mais cela ne gêne que peul'observation; c'est qu'au tour des colonies vigou- reuses les grumeaux du sel sont dissous, et elles apparaissent alors entourées d'une zone limpide. Loin de cacher les colonies, la présence du carbonate insoluble attire l'attention sur elles et rend visible leur action caractéristique. Quant aux végétations que forment les nitrorganismes sur OUGANISMES DE LA NITRIFICATION. 99 ce milieu, il ne faut pas, je le dis tout de suite, se les figurer d'après ce qu'on voit généralement sur les plaques ordinaires, ensemencées par quelque microbe banal. Une nitrobactérie n'est pas du tout capable de l'énergie de croissance connue pour la plupart des microbes. Les colonies englobées dans la gélatine restent toujours petites; les plus grandes d'entre elles ne sont que visibles à l'œil nu, commodes points blancs. Le long- des stries, par contre, il se forme une croûte blanche assez épaisse. Pour l'œil non armé il n'y a, en somme, rien de très caractéristique, si ce n'est le fait même de la formation de colonies sur un milieu de celte nature. Mais cette impression cnange du tout au tout * quand on examine les plaques à un faible grossissement : les colonies de l'intérieur, celles de la surface surtout, revêtent alors un aspect si curieux qu'après les avoir vues même une seule fois, on les reconnaîtra du premier coup d'œil. Cette gélatine minérale est de plus, comme nous l'avons exigé plus haut, très défavorable à la végétation des microbes autres que les nitrobactéries, et ne s'altère que sous l'action de ces dernières. En préservant soigneusement les plaques de la dessiccation, on peut y entretenir la culture de ces org-a- nismes pendant des semaines. J'ai quelques-unes de ces cultures qui durent déjà depuis six semaines, et quoiqu'on n'y remarque plus d'accroissement, les colonies ainsi que la gelée sont encore en bon état. Cependant l'espérance que ce milieu ne permettrait le développement d'aucun organisme étranger a été déçue. Ceux qui accompagnent les nitrobactéries dans l'eau distillée addi- tionnée de sels minéraux poussent également sur la gelée silicique, mais ils n'y forment pas de colonies proprement dites, leurs végétations étant plus que pauvres. Ils font généralement leur apparition avant la nitrobactérie, et s'étendent exclusivement sur la surface en formes de taches blanchâtres, si transparentes, que sans les chercher on ne les apercevrait pas. Ayant atteint bientôt une certaine grandeur, ces taches ne changent plus pendant des semaines entières. Cette circonstance rend les opé- rations d'isolement plus délicates, mais ne les empêche pas. Elles seront décrites en détail dans un prochain mémoire. A tout prendre, je considère ce procédé de culture comme une ressource importante dans l'étude des organismes de la 100 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. nitrificalion. Il n'y a pins désormais de difficullé à les découvrir et à les caractériser parmi les innombrables espèces micro- biennes du sol. Les longues séries de cultures successives, des- tinées à les purilier, ne sont plus nécessaires. En introduisant directement un peu de terre dans la gelée silicique, on pourra tout de suite trouver le miiîrobe actif. Il est préférable, cepen- dant, de provoquer préalablement la nitrification dans une solu- tion aqueuse par une trace de terre, pour, de là, faire le premier ensemencement sur le milieu solide. Dans ce cas toutes les colo- nies, qui y apparaissent, sont absolument uniformes, il n'y a ni à choisir, niàdouter. Veut-on avoir tout de suite la preuve qu'elles nitrifient, il n'y a qu'à prélever sur la plaque un petit morceau de gelée, gros comme un grain d'orge, et le jeter dans un peu d'acide sulfurique additionné de diphénylamine; la tache qui s'y forme au moment même du contact, est d'un bleu égalant par son intensité une solution saturée de bleu d'aniline. Ce genre de culture m'a rendu de très bons services pour l'étude morphologique des organismes en question. Il m'a per- mis d'approfondir ce sujet, de suivre sans lacune le développe- ment de quelques-uns d'entre eux, et de rendre leur caractéris- tique morpliologique aussi complète qu'on peut le désirer. Ces observations feront l'objet d'un mémoire en préparation. SUR UNE ACTION DIRECTRIGEV:» Ql EXliKCENT CKUTAINS COUI'S SUR LES TUBES SPORANGIFÈRES DE « PHYCOMYCES NITENS IV\H M. F. ELFVING i> Ou sait que les tubes sporangifères de la mucorinée Plnjco- iniiceti nitvns se prêtent singulièrement aux recherches sur l'irri- tabililé du protoplasma végétal. Sous Tintluence de la lumière et de la pesanteur, ilsalîectent des directions déterminées, qu'ils cherchent à reprendre, si l'on les en a écartés, par des courbures assez promptes, dues à une croissance inéquilatérale de l'organe. Grâce à la sensibilité extrême de ses tubes, je suis parvenu à découvrir une action physiologique de quelques corps à distance. Si l'on dispose au-dessus d'une culture vigoureuse de Phi/- comijces, telle qu'on l'obtient en semant quelques spores sur du pain humecté, une plaque de fer en position verticale (6g. 1), et qu'on place le tout dans l'obscurité à une température de lo-20'^, on trouvera au bout de quelques heures que les tubes jeunes, au lieu de pousser verticalement, comme ils le font ailleurs, se sont courbés de tous côtés vers le fer. Cette attraction du métal se manifeste à une distance de quelques centimètres. Arrivés au contact avec la plaque, les tubes se courbent irrégulièrement, comme après avoir heurté contre un solide quelconque. Egalement actifs sont le fer de fonte, le fer battu et l'acier. Lanaturedela surface du métal est sans imj)ortance ; aumoins l'attraction est manifeste avec du fer poli, limé, ou un peu rouillé. Parmi les autres métaux, je n'ai trouvé que le zinc et l'alu- minium qui montrent le même effet, quoiqu'à un degré infini- ment plus faible, souvent incertain. Inactifs sont platine, argent, or, cuivre (fig. 2), plomb, cadmium, étain, antimoine, bismuth, cobalt, nickel; inactif est aussi le laiton. Le magnétisme ne joue aucun rôle dans ce phénomène, car un bâton de nickel, assez fortement magnétique, était sans action, tandis qu'un bâton de fer de même dimension, qui n'était pas sensiblement magnétique, provoquait des courbures très nettes. II ne peut non plus s'agir ici d'un effet des rayons lumineux ou calorifiques, le phénomène s'accomplissant avec des pièces 102 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. de fer restées un an à l'obscurité et à la température ordinaire. On ne peut pas invoquer l'électricité comme cause de ces courbures, le fer occupant une place peu caractéristique dans la série électrique; du reste, une plaque de fer en communication avec la terre reste active. Fig. 4. — Plaque de fer. Il s'agit ici évidemment d'une action spéciale du fer (zinc, aluminium). Je dois ajouter que je n'ai pas retrouvé cette pro- priété du fer dans ses combinaisons telles que la magnétite, l'hématite et le ferrocyanure de potassium. Il y a un certain nombre de corps, outre le fer, qui provoquent PIIYCOMYCES NITENS. 103 chez les tubes de PIn/romifces des courbures analogues. Tels sont la cire à cacheter, la colophane, le papier lisse, la cire, la soie, le coton, l'os, la laine, le linge, le caoutchouc, le bois, le soufre, etc. Comme corps inactif ou doué, dans quelques échan- tillons, d'une action très faible, il faut citer le verre. Fig. 2. — Plaque de cuivre. Quand on emploie des corps qui attirent de l'humidité, il faut qu'ils soient bien secs pour que le phénomène se manifeste bien nettement, les tubes de Phycomyces fuyant, comme on le sait, les surfaces humides, llumecte-t-on, par exemple, légère- ment l'un des côtés d'un carton, on trouvera celui-ci sans action tandis que l'autre est encore actif; il suffît de dessécher complè- d04 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. temeiit le carton pour faire reparaître son activité. De même, en employant du papier à écrire, on n'obtient pas d'action en opé- rant dans une atmosphère très humide. Avec la cire à cacheter, qui n'est pas hygroscopique, l'expé- rience réussit aussi dans une atmosphère saturée d'humidité. Cependant, par un séjour prolongé (15 jours), dans un tel milieu, le corps perd la propriété en question. Il suffit, pour la faire reparaître, de le frotter fortement. On pourrait supposer que le phénomène est dû à une faible tension électrique, faisant naître dans l'intérieur des cellules des changements d'où résulte la flexion. Mais comme l'électroscope à feuille d'or n'a très sou- vent pas assigné d'électricité chez des corps nettement actifs; comme la cire à cacheter est restée [active après 4 jours passés dans une atmosphère très humide; comme enfin je n'ai jamais réussi à rendre actifs des corps inactifs, comme le verre et le laiton, en les électrisant de manières différentes, il faut, jusqu'à preuve contraire, admettre qu'il s'agit ici d'une propriété spé- ciale de structure interne des corps mentionnés. Parmi les corps actifs, il faut encore citer des êtres vivants, tels que les racines vigoureuses des pois, des haricots, des lupins, des ricins eu germination, ainsi que l'hypocotyle des haricots; la région en croissance de ces organes attire faible- ment les tubes de Phycomyces. Enfin, ces tubes exercent eux-mêmes sur leurs voisins une influence de même nature, quoique dans un sens opposé; il y a entre eux une répulsion faible. Pour la rendre manifeste, il faut éliminer l'influence directrice de la pesanteur et de la lumière, en faisant tourner lentement, autour d'un axe horizontal et à l'obscurité, une culture de Pliycomyces. Les tubes qui occupent les bords de la culture se courbent bientôt en dehors, souvent sous un angle presque droit, tandis que ceux du centre, entou- ]"és de tous côtés, continuent à pousser en ligne droite. On serait tenté de croire que ceux-là fuient les produits de respiration de leurs voisins et cherchent de l'air, mais le phé- nomène s'observe aussi quand on fait passer au travers d'une culture, disposée comme on vient de dire, un courant d'air assez fort pour enlever ces pi'oduits; du reste, Pliycomyces n'éprouve pas la moindre influence, quant à sa direction, de l'acide carbo- nique s'écoulant par un tube étroit placé au-dessus d'une culture. RECIIIIIKJIES SUR LES NODOSITÉS RADICALES DES LÉGUMINEUSES ' Pau m. Em. LAURENT. Travail fait au laboratoire do cliiniie bioIo,s;i(|iic di' la Sorhniine à riastiliit Pasteur. Bien peu de questions de physiologie végélalo ont été l'objet d'autant de controverses que celle de l'origine de l'azote des Légumineuses. Depuis deux mille ans, ces plantes sont consi- dérées, à bon droit, par les agriculteurs, comme anuHiorantes, c'est-à-dire, qu'elles semblent rendrele sol plus fertile lorsqu'elles l'ont occupé pendant un certain temps. Cette propriété, qui implique l'assimilation par ces plantes de l'azote libre de l'atmo- sphère, a paru longtemps paradoxale aux chimistes et aux physiologistes. Elle n'a commencé à entrer dans la science que lorsque M. Hellriegel fit voir que la végétation des Légumineuses, dans les sols pricés d'azote, ne peut réussir complètement que si leurs racines sont pourvues de petits tubercules particuliers. Mais que sont ces tubercules, et à quelle cause sont-ils dus? On les connaît depuis longtemps, et les botanistes du xvn® siècle les mentionnent; on les a pris tantôt pour des productions physiologiques, tantôt comme le résultat de l'intervention des microbes *. Quelques détails sur leur structure ne seront pas inutiles pour bien comprendre leur genèse et leur étiologie. 1. Les points principaux exposés dans ce travail ont été présentés dans une note préliminaire ù l'Académie des Sciences d(3 Paris, à la séance du 17 novembre I8'J0. 2. Sous le nom de microbes, Je comprends l'ensemble des organismes infé- rieurs. i06 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. LES NODOSITES. Les nodosités radicales ont été observées sur la plupart des Légumineuses, et sont si régulièrement présentes en particulier chezles Papilionacées, que certains botanistes les ont considérées comme un caractère de famille. Très communes dans les genres Trèfle, Pois, Fève, Lupin, elles sont beaucoup plus rares chez les Genêts, les Astragales, et surtout la Pistache de terre (Arachis hiipogœa). Elles ne sont du reste pas toujours également abondantes dans la même espèce : certains sols, en général les moins fertiles, sont plus favorables que d'autres à l'apparition des tubercules. Des formations analogues, souvent plus volumineuses, se rencontrent sur les racines des Aulnes et des Elœagnus. En dehors de ces deux genres, on ne connaît de nodosités radicales, comparables à celles des Légumineuses, sur aucun autre végétal à l'état normal. La forme de ces tubercules peut différer beaucoup dans des espèces voisines, mais elle est assez constante dans la même espèce. Tantôt les tubercules sont simples et sphériques (Haricot), ovoïdes ou elliptiques (Trèfle, Gesse), tantôt ils présentent des ramifications plus ou moins nombreuses nées à la suite de dicho- tomies successives (Vesce, Luzerne). Les Lupins, surtout le Lupin jaune, ne sont pas pourvus de nodosités abondantes; souvent, au voisinage du collet, il se forme une masse volumi- neuse, d'abord latérale, mais qui, plus tard, enveloppe toute la périphérie. A première vue, les tubercules radicaux ne semblent pas obéir aux règles qui président à l'apparition des racines nou- velles sur les axes radicaux. Il n'en est rien cependant et. comme l'ont démontré MM. Van Tieghem et DouUiot ', la position occupée par les nodosités se trouve en relation constante avec le système libéro-ligneux ou fibrovasculaire de la racine. Une couche cellulaire spéciale, le péricycle ou péricambium 1. Bull de la Sue. bot de France, t. XXXV, p. lOo, 1888. NODOSITÉS DES RAGIN-ES DE LÉGUMINEUSES. 107 donne naissance anx tubercules de môme qu'aux radicelles des Légumineuses, Elle se trouve à la périphérie du cylindre central, et confine donc à l'assise cellulaire la plus interne du système cortical. Cette assise, appelée endoderme, et parfois aussi les assises corticales les plus internes, agrandissent et cloisonnent leurs cellules autour des endroits où des formations latérales vont se produire ; elles constituent la poche digestive, chargée de digérer le reste de l'écorce. A l'état adulte, un tubercule présente toujours deux catégo- ries de celhiles nettement distinctes. Les unes occupent la Fig. 1. Gross. SO. p. Poils radicaux; v, vaisseaux;;) b, parenchyme à bactéroïdes; m, ineristème; }>> péricycle ; end. endoderme. portion centrale; elles sont relativement très grandes, et, de prime abord, semblent remplies d'un contenu dense et fortement granuleux. Autour d'elles des couches cellulaires plus ou moins nombreuses constituent l'écorce; leurs cellules sont plus petites et hyalines. Au milieu de celles-ci, existent des cordons libéro- ligneux en relation avec un ou plusieurs faisceaux corres- pondants de la racine. Dans la grande majorité des cas, on as i découvre sur une coupe transversale un nombre variable de faisceaux libéro-ligneux disposés en cercle autour des grandes cellules centrales. Des coupes longitudinales permettent de constater que ces faisceaux partent de l'axe radical, ordinaire- ment en un tronc unique qui se bifurque plusieurs fois, et dont les branches divergent vers la périphérie. Chaque cordon com- prend, au moins sur une portion de son parcours, une région ligneuse et une région libérienne. i08 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. Lorsque la nodosité est très jeune, elle porte encore des poils radicaux; mais ils disparaissent par la suite. En même temps, elle prend une teinte brune, et ses cellules les plus externes se subérisent, au moins dans la portion parvenue à l'état adulte. Parfois aussi les tubercules deviennent rougeâtres; c'est le tissu central qui prend cette coloration. Les cellules les plus extérieures de l'écorce sont souvent l'objet d'exfolialions partielles ; leur surface prend alors un aspect assez irrégulier qui rappelle celui de certaines pilorbizes. Reprenons lexamen du tissu à g-randes cellules qui occupe la région centrale des nodosités. II se distingue très nettement des cellules hyalines environnantes; çà et là des éléments ont conservé leur aspect ordinaire, ce qui annonce déjà que la trans- formation n'est pas due à une cause générale, maisest provoquée par un agent particulier localisé à certains endroits. Un grossissement suffisant met en évidence, tout au moins dans les cellules situées vers la base de la nodosité, des éléments bactériformes extrêmement abondants. Parfois ils paraissent mobiles; mais ce n'est pas autre chose que l'effet du mouvement brownien, car les mouvements persistent dans les solutions iodées et d'autres liquides toxiques. Des fragments de tubercule écrasés sur une lame, et examinés au microscope, permettent d'observer les aspects très variés des petits corps bactériformes, que je désignerai sous le nom de bactéroides à l'exemple de M. Brunchorst. Ils ont environ 1 ij. de diamètre transversal, mais il y en a de plus gros et de plus minces. Les uns rappellent à s'y méprendre l'aspect des bacilles les plus communs, avec cette dillérence que leurs contours sont moins réguliers (Haricot, Cytise, Lupin). D'autres sont rami- fiés et simulent soit la lettre Y ou bien la lettre T (Pois, Vesce) , il y en a parmi ceux-ci qui ont des formes plus irrégulières encore par suite de ramifications dichotomiques. Ainsi que l'ont fait remarquer M. Frank et M. Beyerinck, la forme des bactéroides est assez constante chez une même espèce, ou, tout au moins, il existe pour chacune une forme dominante. Cette règle n'est cependant pas absolue, et je signalerai plus loin une cause assez intéressante de variations. Sous l'iniluence des réactifs, les bactéroides se comportent comme les bactéries banales : ils se colorent en jaune par l'iode, } NODOSITÉS DES HACINES DE LÉGUMINEUSES. 100 absorbent avec la plus grande facilité les couleurs d'aniline, particulièrement la fuchsine et le violet de méthyle, ainsi que rhéniatoxyline. Au chapitre HT. j'aurai roccasion de discuter la nature des bacléroïdes. Ce sont ces corpuscules qui attirent le plus l'attention de ceux qui observent pour la première fois des nodosités au micro- scope, lly a cependant d'autres éléments non moins intéressants dans le tissu à bacléroïdes. Les cellules qui constituent ce tissu ne sont pas semblables dans une nodosité en voie de croissance. Nous venons de voir que les plus anciennes sont bourrées de bacléroïdes; à côlé de celles-là, il y en a qui sont creusées de plusieurs vacuoles ou d'une grande vacuole centrale entourée d'une couche protoplasmique relativement épaisse ; ony distingue un noyau volumineux avec nucléole apparent; enfin les cellules les plus jeunes, voisines du tissu générateur ou méristème, se trouveut vers le sommet du tubercule. Ce méristème reste actif pendant un temps assez long-, de sorte que sur une coupe longitudinale de nodosité, perpendiculaire à la racine mère, on distingue le plus souvent des cellules à bacléroïdes aux diffé- rents élats de développement. Une telle coupe, traitée par une solution iodée, présente la coloration bleue caractéristique de l'amidon, tout au moins dans une partie du tissu central. Au microscope, on reconnaît la présence de grains d'amidon dans la plupart des cellules à bacléroïdes, et aussi dans celles qui, arrivées à leur taille adulte, n'eu contiennent' pas encore. Généralement, une assise ou deux des cellules internes de l'écorce renferment également de lamidon. Cet amidon n'est que transitoire, et un rôle important lui est réservé dans la physiologie du tubercule. Dans les cellules les plus jeunes du parenchyme à bacléroïdes traité par l'iode, un examen microscopique très attentif permet d'observer des filaments protoplasmiques non cloisonnés, assez irréguliers, qui traversent les membranes cellulaires et se renflent çà et là en masses ovoïdes ou sphériques, sessiles ou pédicellées, isolées ou réunies par deux ou trois sur un même support. Découverts d'abord par M. Prillieux' et par M. Frank % ces fila- 1. Ihill. lie 1(1 Sociéli' bolan, de France, t. XXVI, p, 98, 1879. -2. Bolan. Zeilung, IBlU, p. 1)77. 110 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. ments ont élé l'objut d'observations très soignées de la part de M. Tuillemin' et surtout de M. Marshall Ward', qui les vit pénétrer dans les racines par les poils radicaux. 11 est difficile de comprendre l'opinion de M. Beyerinck% qui, s'attachant surtout à l'étude biologique des bactéroïdes, fut porté à considérer les filaments muqueux comme les restes des tonnelets nucléaires. M. Tschirch' avait, quelque temps auparavant, adopté une opinion analogue. M. Kny^ et M. Prillieux considéraient ces productions comme semblables à celles que donnent certains myxomycètes, entre autres le Plasiimliopfwra Brassicœ, qui cause la hernie des racines de plusieurs crucifères. M. Prazmowski*^ voit dans les filaments intracellulaires des formations protoplasmiques appartenant au microbe des tuber- cules, et dans lesquelles des bactéries spécifiques naissent et se multiplient avant de se transformer en bactéroïdes. Les cordons protoplasmiques seraient donc des sortes de zoogiées. Récemment, M. Frank'' a émis une opinion entièrement différente : la légumineuse produirait les filaments, dans le protoplasme desquels les bactéroïdes prendraient naissance sous l'influence de Micrococcus particuliers. Dès 1874, M. Eriksson* avait identifié les filaments dont il vient d'être question à un véritable mycélium pourvu d'une membrane cellulosique propre. L'existence d'une telle mem- brane a été de nouveau affirmée par M. Vuillemin% M. Pichi '" et plus récemment, par M. A. Koch ". Ces savants ont pu la décou- vrir après avoir traité des coupes par Thypochlorite de soude ou l'eau de Javel, et ensuite par le chlorure de zinc iodé. 1. Annales de la Science arironomùjae, tio année, l. II, p. 1-21, 1S88. "l. Philosoph. Transactions of the Roy. Society of Londnn, B, vol. 178, p. o39, 1«87, et Proceedinçis ofthe Roy. Society, vol. XLVI, p. 431, 1889. .S. Rolan.' Zeilung. -1888, n^' M) à oO. 4. liericlUa d. deulsch. botan. Gesellsch., t. V, 1887. 5. Botan. Zeilsclirift, 1879, p. 57. 6. Rolau. Ccnlmlbl., XXXVI, 1888, etDieWurzelknullcheuder Erbse, Landwirtsch. Versuchs-Slationen, XXXVII, p. •161, 18'J0. 7. Berichle de deutsch. botan. Gescllsch., t. VU, p. 33:2, 1889, et Ueber die Pilzsym- biose der Loi^uminosen, Landwirthscli. Jalirbiirhern, IS'JO. 8. Stiulicr itfver Loguminemas rolkuolar, Luud, 1874, 9. Loc. cit., p. 189. 10. Alti d. Societa Toscana d. scicnze nalar., 1888. 11. Botan. Zeilung, 1890, p. 607. NODOSITÉS DKS lUCINES DE LÉGUMINEUSES. 111 Cependant, la présence d'une enveloppe cellulosique ne ter- mine pas toute discussion sur la nature du microbe des nodosités. Plus d'un point important relatif à la morphologie de cet organisme est resté jusqu'ici des plus controversés. Dans l'étude des nodosités et des êtres vivants qui les habitent, il importe de renoncer aux moyens employés d'ha- bitude pour les travaux histologiques. Ainsi l'immersion dans l'alcool donne de mauvais résultats; les tilaments deviennent alors très difliciles à distinguer au milieu du contenu cellulaire coagulé. Mieux vaut ne les étudier que sur des coupes fraîche- ment préparées. L'iode sufht pour les rendre plus apparents ; ce réactif les colore en jaune. Les couleurs d'aniline ordinaire- ment employées ne conviennent guère, parce qu'elles n'ont d'action que sur le protoplasme mort. Il en est tout autrement du violet dahlia, cet excellent réactif que M. Certes a fait connaître comme capable de colorer les protoplasmes vivants. Des coupes très minces de nodosités de Pois, de Fève, de Gesse cultivée, etc., etc., plongées pendant quelques minutes dans une solution aqueuse de violet dahlia, m'ont donné d'e.xcel- lents résultats. Dans toutes les cellules du parenchyme à bacté- roïdes, l'existence des filaments muqueux est alors des plus nettes. Ils traversent les cellules, et présentent le plus souvent un épaississement local au niveau des cloisons cellulosiques qu'ils traversent. Pour M. Frank, cette particularité, de même que la forme amincie et pointue de certains rameaux, s'expli- quait (1879) par l'étirement des filaments dans les cellules en voie de croissance. Certes, il y a une part de vérité dans cette interprétation; mais il est aussi vrai que les filaments protoplas- miques s'appliquent fréquemment contre les parois des cellules qu'ils traversent (voir pi. II, fig. 7 et M). Grâce à la coloration par le violet, on les voit parfois se diviser en ramuscules très délicats qui se perdent dans le protoplasme environnant. Un fait beaucoup plus important m'a été révélé par l'emploi du violet dahlia. Les productions arrondies que présentent les filaments ont été considérées dès 1879 comme des suçoirs par M.Frank. Pour M. Prazmowski, ce sont des sortes de sporanges où s'accumulent les bactéries avant de se répandre dans les cellules extérieures. Ni l'une ni l'autre de ces opinions ne sont exactes En efi'et, H2 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUlî. le violet dahlia employé en solutions aqueuses diluées donne, après quelques minutes, à la plupart des masses globuleuses, un aspect mamelonné, parfois hérissé, que l'on ne pourrait que très difficilement soupçonner en l'absence de coloration. Chacune présente un certain nombre de ramifications très courtes dont les slérigmales des Aspergilliis nous donnent une idée assez exacte. Cette observation, faite en premier lieu sur la Gesse cultivée et sur le Pois, fut vérifiée sur une assez grande quantité de Papilionacées. Toutes les espèces ne conviennent pas d'une manière égale ; ainsi chez la Fève, les petites aspérités en question sont peu apparentes, et l'organe qui les porte a plutôt l'aspect d'une mûre. L'observation de ces rameaux hérissés de pointes très courtes et très délicates me fit tout de suite supposer que c'était sans doute là l'origine des bactéroïdes. Le pressentiment était des plus fondés. D'innombrables coupes furent faites avec soin dans des nodosités d'âg'e variable de (iesse cultivée et de Pois. Je finis par découvrir un certain nombre de renflements muqueux auxquels des bactéroïdes typiques étaient encore attachés. J'ai représenté, planche IL plusieurs de mes observations. Ce n'est pas tout. L'existence de ces stérigmates à bacté- roïdes me fit observer avec plus d'attention certaines aspérités que j'avais remarquées le long des filaments muqueux; elles sont souvent groupées en petit nombre vers l'extrémité amincie de certains de ces filaments. Bientôt, j'acquis encore la con- viction que ces petites pointes latérales se continuent parfois en filaments très minces qui se perdent dans le protoplasme cellu- laire ; je les ai vues aussi en continuité évidente avec des bacté- roïdes; d'autres se terminent brusquement à peu de distance de leur insertion, ce qui permet de supposer que leurs productions spéciales ne s'étaient pas encore formées ou venaient de s'en détacher. Yoici encore un détail qui confirme la production des bactéroïdes par les filaments protoplasmiques : dans l'examen des préparations, il m'est arrivé de rencontrer des cellules laissées intactes par le rasoir et dans lesquelles un petit nombre de bactéroïdes environnaient les renflements muqueux. Ce n'est pas une opinion nouvelle que de considérer les NODOSITÉS DES RACINES DE LEGUiMlNEUSES. 113 t. aclt- „-.>r les ■ bacléroïJes comme des productions bourg-eonnantes des fila- meiils observés dans les nodosités. L'idée fut d'abord émise par iM. Kny {loc. cit.), puis par M. Frank [loc. cit.), qui l'aban- donna depuis pour une opinion toute différente. M. Marshall Ward l'a reprise sans laffirmer d'une manière catégorique : les bactéroïdes semblent, dit-il, naître des hyphes par bourgeonne- ment {loc. cit. p. 547). Les observations du botaniste anglais devaient rencontrer peu de crédit. On révoquait même en doute l'autonomie biolo- gique de ces corpuscules. Comme je l'ai exposé plus haut, il est très facile, à l'aide du violet dahlia, d'observer les filaments du microbe des nodosités. Le moment est venu de faire une remarque qui n'est pas sans intérêt. Dans les nodosités des Lupins et du Haricot commun, l'existence des hyphes a été niée par maints observa- teurs. Ils étaient de bonne foi, mais la prudence ne permettait pas de conclure avec autant de précipitation. M. Brunchorst' a également contesté la présence des hyphes chez le Haricot d'Espagne, la Podalyre, le Desmodiam caacidcme et deux autres espèces peu connues. M. Prazmowski ^ a signalé la présence de ces filaments dans les nodosités du Lupinus perennis et du Pltaseolus vulgaris. J'ai fait la même constatation pour le Lupinus luteiis et le Phascohis multiflorus sur des coupes colorées par le violet dahlia (voyez pi, I, fig-. 2, 3 et 4). Chez ces espèces, les filaments disparaissent de bonne heure, et ne laissent d'autre trace que de rares amas protoplasmiques de forme très irrégulière. Cette destruction plus ou moins complète des hyphes est assez générale, et se fait quelque temps après la production des bactéroïdes. Dans l'inter- valle, les noyaux des cellules à bactéroïdes se désorganisent, comme le prouve la diminution du pouvoir chromatique dans les tissus adultes. Je reviendrai de nouveau sur le cas des Lupins dans le chapitre suivant, et je démontrerai par une voie différente la parenté qui existe entre les organismes des tubercules des Lupins et ceux des autres légumineuses. 1. Berichte d. deutsch., bolan. Gesellsch., t. III, 1883. 2. Botan. Centralblatt, XXXVI, p. :252. 114 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. II n DEVELOPPEMENT DE NODOSITES A LA SUITE D INOCULATIONS. Ce fut M. Prillieux qui remarqua le premier que le dévelop- pement des nodosités sur les racines de Légumineuses peut être provoqué par l'introduction, dans le milieu de culture, de racines pourvues de semblables organes. La même observation fut faite presque simultanément par M. Frank. Déjà à cette époque, on pouvait pressentir la nature vivante de la cause qui produit les tubercules. MM. Hellriegel et Wilfarth * ont confirmé cette opinion par leurs nombreux essais de culture dans le sable, avec ou sans ensemencement de germes du microbe provenant soit des tubercules, soit d'une terre qui avait porté des légumineuses. D'autres essais d'inoculations ont ensuite été entrepris par M. Marshall Ward, M. Prazmowski; M. Beyerinck, M. Bréal -, et par moi-même ^ Pour ma part, j'ai fait, cette année, plusieurs centaines d'essais de culture avec la variété de Pois nain de Grâce ou Gonthier, dont la tige ne dépasse guère 30 centimètres de hau- teur. Mes essais m'ont permis de faire quelques remarques que je crois utile de signaler. En premier lieu, je me suis appliqué à démontrer rigoureu- sement que l'intervention d'un germe est nécessaire au dévelop- pement des nodosités. C'est là une vérité que différents auteurs ont cru établir, sans toutefois apporter des preuves tout à fait concluantes, parce qu'ils n'opéraient pas dans des conditions de stérilité absolue. Or, en pareille matière, onale droit de penser que toutes les probabilités, si giandes qu'elles soient, n'équivalent pas à une certitude, et qu'il est besoin de preuves décisives. C'est dans l'intention de les donner que j'ai fait croître des pois nains dans des conditions complètes de stérilité K 1. Untersuchungen liber die Stickstoffnahrung der Gramineen und Leguminôsen. Berlin, 18«8. 2. Annales agronomiques, t. XIV, p. 481. 1888, et t. XV, p. o29, 1889. o. Bulletin de V Académie royale de Belgique, 3* série, t. XI\, p. 764, 1S90. 4. Dans le numéro du âb décembre duruier delà Botan. Zeitung, M. Beyerinck a décrit un procédé dillérent de celui que j'ai adopté, pour cultiver des plantes à l'abri des microbes. •3 ^7.-. NODOSITES DES RACINES DE LEGUMINEUSES. H Les graines avaient été d'abord stérilisées par l'immersion, pendant quinze minutes, dans une solution ù l"/oo de sublimé, contenue dans de larges tubes à essais; c'est dans ces tubes bien lavés à l'eau stérilisée que se fit la germination. Le mélange nulritif(iue j'ai employé était composé de : Eau distillée 1000 ce. Sulfate de luagnésium 0,5 gr. — de potassium 0,5 — de calcium 0.5 — de fer 0,01 Phosphate tricalcique 0,5 Chlorure de sodium 0,5 Le mélange était renferuié dans des éprouvettes de 200 ou de 350 centi- mètres cubes, fermées par un bouchon plat coupé en deux moitiés. Entn; celles-ci, dans une petite ouverture centrale, était fixée avec un peu d'ouate la partie inférieure de la tige. Les bocaux des cultures stérilisées étaient fermés d'une façon hermétique avec des bouchons choisis avec le plus grand soin. Ils furent, après remplis- sage, chauffés à l'autoclave; lorsqu'ils furent refroidis, j'introduisis avec précaution la radicule des plantules germées en tubes stériles entre les deux luoiliés du bouchon; enfin, du coton stérile entourait la radicule de manière à empêcher le passage des germes. La graine se trouvait ainsi placée au-dessus du bouchon; afin d'éviter la dessiccation, le bocal fut placé pendant dix jours dans une atmosphère saturée de vapeur d'eau. Six pois ainsi cultivés se sont développés d'une manière normale ; les racines étaient plus longues, môme plus ramifiées que celles des pois inoculés et pourvus de nodosités. Quant aux tiges, elles avaient une douzaine de feuilles, qui sont devenues jaunâtres après l'épuisement des graines. Chaque tige a donné de deux à quatre fleurs, dont une seule a noué et a donné une graine plus petite que celle ({ui avait été semée. L'analyse de deux de ces plantes n'a indiqué qu'un enrichissement minime en azote. Azote des deux graines 19 mgr. — des plantes récoltées 20,5 mgr. A la fin de la culture, j'ai vérifié la stérilité des mélanges nutritifs par des ensemencements sur aiilieux gélatinisés appropriés; cinq se sont montrés' stériles; le sixième contenait du Mucor racemosus. Si l'on compare les racines d'un pois privées de nodosités avec celles d'un autre qui a été inoculé avec succès, on est toujours frappé de la rami- fication plus abondante des premières. La plante multiplie ses organes d'absorption comme si elle était prévenue de l'insuffisance de son alimenta- lion. Telle est également la ramification de maintes espèces cultivées dans l'eau distillée et dans les sols stériles. Nous sommes donc certains qu'un organisme particulier est indispensable à la production des nodosités. On a cru et dit que ' H6 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. c'est l'une des bactéries banales qui vivent et pullulent dans le soL II n'en est rien, comme je m'en suis assuré par l'inoculation, à des pois maintenus jusque-là stériles, de plusieurs races de ces microbes, provenant du sol et de l'air et qui avaient été isolées avec le plus grand soin. Jamais la moindre nodosité ne s'est développée sur les racines soumises à ce traitement. C'est donc à tort que l'on a identifié les microbes des nodosités avec des bactéries ubiquistes. Je viens d'attirer l'attention sur l'allongement et la ramifica- tion plus touffue des racines des pois qui ne sont pas infectés. Une différence non moins curieuse s'observe sur les pieds cultivés dans le mélange nutritif additionné de nitrate de sodium ou de sulfate d'ammoniaque à I700. Les pois souffrent dans ce dernier mélange, mais ils sont très prospères en présence de nitrate de sodium; leurs tiges sont vigoureuses et robustes; leurs feuilles larges et d'un vert foncé; les fleurs nouent parfaite- ment. Quant aux racines, elles sont ramifiées en proportion du développement foliaire, mais ne présentent qu'un très petit nombre de tubercules. Des observations analogues avaient été faites depuis long- temps par M. de Yries* sur le Trèfle rouge, et plus récemment par M. Schindler ^ et Yines ^ Ces auteurs avaient observé que beaucoup de légumineuses, cultivées dans des sols ricbes en engrais azotés, ne portent presque pas, parfois même pas du tout de nodosités radicales. Dans ce cas, ces plantes se condui- sent comme si elles avaient conscience de l'inutilité de leur asso- ciation avec le microbe des nodosités. Je reviendrai sur ce point au chapitre IV, et dirai comment je le comprends. Il n'y a pas que les substances azotées qui fassent sentir leur influence sur la production des nodosités; celle-ci dépend encore des matières salines qui existent dans le milieu ambiant. Pour mettre en lumière celte action des substances miné- rales, j'ai cultivé des pois dans l'eau distillée et dans des solu- tions privées de soufre, de phosphore, de potassium, de calcium, de magnésium ou de fer ; j'avais soin d'ajouter au liquide quel- ques nodosités écrasées pour en faire sortir le suc. 1. Landtoirth. Jahrbûcher, t. VI, 1877. 2. Botan. Cenlralblatt, t. X\^III, 1880. 3. Annals of Botany, vol. 11, 1888-89. ISÛDOSITÉS DES RACINES DE LÉlUJMINl'USES. 117 L'absence d'acide pliosplioriqiie, de chaux et de mai^nésie détermine une végélalioii raboui^rie et supprime l'aptitude à pro- duire des nodosités. Sans potasse et sans fer, les plantes pous- sent mieux, les racines sont ramifiées et assez vigoureuses, mais ne portent guère de tubercules. Pour ce qui est du soufre, ni la végétation des pois ni le développement des nodosités ne paraissent se ressentir de son absence, sans dcwite parce que la graine renferme une quantité suffisante de cet élémniit. Il con- vient de remarquer à ce propos que les graines de Pois sont par- ticulièrement pauvres en chaux et en magnésie, et beaucoup plus riciies en potasse. Dans l'eau distillée, les plantes se comportent beaucoup mieux que dans les solutions privées d'acide phosphorique, de chaux ou de magnésie ; même leurs racines sont pourvues de quelques nodosités. C'est, du reste, un résultat qui est conforme à ce que l'on observe lorsqu'on fait des cultures aqueuses de maïs ou d'avoine comparativement dans l'eau distillée et dajis des mélanges privés de chaux ou de potasse. Les plantes croissent mieux dans l'eau pure que dans ces derniers milieux. Il semble alors que certaines combinaisons salines, utiles dans le mélange nutritif complet, aient la propriété de nuire à l'utilisation des réserves de la graine. L'influence si marquée des phosphates et des sels de calcium et de magnésium sur la croissance des pois et leur aptitude à donner des nodosités mérite d attirer l'attention, et n'est pas sans avoir une certaine importance pratique. J'ai signalé plus haut la réussite constante des cultures de pois inoculées avec le contenu des nodosités. Rien n'est plus facile que d'obtenir, à jour fixe, des pieds pourvus de nodosités radicales. Lorsque les essais ne doivent pas être faits dans des conditions depureté absolue, il suffit de faire germer des graines de Pois nains, variété de Grâce, sur une toile à larges mailles tendue au-dessus d'un cristallisoir rempli d'eau et placé sous une cloche. Quand les radicules ont o à 8 centimètres de lon- gueur, on les pique avec une pointe de verre ou même une aiguille ordinaire plongée, au préalable, dans une nodosité de pois ou d'une autre légumineuse. Lorsque le temps est favorable à la végétation, les premières nodosités apparaissent sur les 118 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. racines environ dis jours après l'inoculation. Ces tubercules se trouvent diperséssur les racines et non pas limités au voisinage des points ditifeclion. Cela n'arien d'étonnant, carune partie des germes apportés par l'opération peuvent se mélanger au liquide de culture. Le microbe envahisseur peut aussi se propager de proche en proche dans l'intérieur des tissus, comme je l'établirai plus loin (IV). Lorsqu'on se contente de déposer la semence dans le liquide sans blesser l'écorce des racines, il faut généralement deux à quatre jours de plus avant de voir apparaître les premières nodo- sités. Les microbes trouvent une porte d'entrée toute préparée dans les racines blessées, tandis qu'ils doivent pénétrer dans celles qui sont intactes. Enfin, j'ai remarqué qu'un délai de quelques jours est néces- saire lorsqu'on remplace, dans les inoculations par piqûre, le contenu de nodosités par un peu de terre qui a porté des légumi- neuses. II semble que le microbe se trouve dans la terre à l'état de repos, et qu'il mette un certain temps avant de pouvoir entamer les racines de la plante hospitalière. La semence nécessaire aux inoculations ne doit pas néces- sairement être empruntée à l'espèce que l'on se propose d'infecter. Ainsi, j'ai inoculé avec succès des Pois nains avec des nodosités prises sur les espèces indiquées ci-dessous. Quelle que soit la nature de l'espèce qui a fourni la matière inoculée, il se développe toujours des nodosités ; le nombre et les dimensions de celles-ci varient avec la nature des espèces auxquelles on a emprunté la semence. Le tableau suivant résume les résultats de mes observations faites dans cet ordre d'idées. Je crois utile de faire remarquer que les nodosités servant aux inoculations étaient plongées pen- dant dix minutes dans une solution de sublimé à 1 "/ooî parfois, elles étaient simplement lavées vivement au moyen d'un jet d'eau stérilisée lancée au point où j'allais percer la nodosité ; il m'est aussi arrivé de stériliser cet endroit au moyen d'un objet en métal porté au rouge. N01)0SITl<:S DES RACINES DE LÉGUMINEUSES. 119 NAÏirilE l>i;s KSPÈCES ijVl ONT FOUItM UEMARftUES FAITES I.A StmSTWCE IXOCl'I.KE AUX VOIS SIIU LES xonosiTKS Acacid li'iilophi/llii. Nombreuses, de moyenne grosseur. — siini'i'oli'tis. » » » Mi»i()f) » DolicliDS iiirhuiophlIidlinKS. » » » Ilarirot cnnimtin (PArrsvo/'/.s- rid- » » » (/nris.) » eL grosses. Pois {Pisinii xatiriiin.) (îesse cuUivop (LalliiirNs snlirus.) )i )i — odorante ( — (jdoralus.) » » — sans î*i\i\\\es{fjiiliyrHsapfiaca.} >t » Fève (Fahd nihinvis.) » » Lentille {Kvnini L'iis.) Rares et petites. Ma^ncnaudicr {Cohih'd (1 i-hoi-i\scf'iis.) Assez nombreuses et grosses. Psonih-d (iciiiilis. Quelques-unes, grosses. Lotus iilii/iiwsKs. Nombreuses et grosses. — JucoIkviis. » de moyenne grosseur. TetnKjoiiolohHs i)tiri>iirn(s. » " » Securigem comllhia . n n » Trifoliinn inranial/nii. » et grosses. — pvdtciisi'. » 1) — ri'iii'iis (Irètle blanc ) Nombreuses et grosses. ■ — c/i'i/diis. » et assez petites. — sii/ili'rrnuciim. Rares et petites. Mi'lilotxs iilhiis. » et grosses. — oflicinulia. » » Limaçon {Mi'dicngo acutellatu.) Nombreuses et assez petites. Lupuline ( — lapnUnn.) Rares et grosses. Luzerne ( — sulica.) » » Mfdicago orhicularis. » » — maculat/i. » )) Gfniista sihirico. » » — spachifiiKi. » » Jjijjiiiii.s hdciis. M i) — Cniisksliiniltsii. W ») — trirnidj-. » ). — l'Ii'ijiins. )1 » — iilhnx. » » Ces renseignements montrent ^jue les espèces qui convien- nent le mieux pour communiquer au Pois l'aptitude à produire des tubercules sont le Pois, la Fève, les Gesses, les Acacias, les Lotiers et certaines espèces de Trèfle. Par contre, les Mélilots, les Medicago, les Genêts et surtout les Lupins sont beaucoup moins favorables aux essais d'inoculations avec le Pois. Les divers genres indiqués au tableau sont rangés selon leurs affinités botaniques. Après examen comparatif des résultats, on est porté à croire que le microbe des tubercules se propage 420 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. mieux sur les racines d'une espèce de légumineuse, lorsque celle-ci nest pas trop différente de l'espèce qui a fourni la semence. Il ne convient cependant pas d'exagérer cette remarque, car le développement des nodosités dépend aussi de l'âg-e des tubercules inoculés aux racines à infecter. Influence de V âge des nodosités. — Dansles essais d'inoculations rapportés au tableau, la semence était toujours empruntée à des tubercules jeunes, en voie de croissance. Souvent même, ceux- ci étaient percés avec une pointe en verre à l'endroit où le parenchyme continue à se diviser; le microbe y est encore à l'état de vie très active. lien est tout autrement lorsque la subs- tance inoculée provient d'un tissu adulte, dune nodosité qui cesse de s'accroître. Aussi, pour assurer le succès des inocula- tions, il importe de les pratiquer avec des tubercules récoltés sur des plantes dont la végétation n'est pas trop avancée. C'est M. Beyerinck qui signala le premier ce fait intéressant. Dès que les fleurs commencent à se former., la vitalité du microbe diminue sensiblement; il met plus de temps à se développer, à produire des tubercules, et en donne une quantité moindre. Plus tard, beaucoup d'inoculations restent stériles sur les racines du Pois. Le microbe trahit une sorte de malaise, et les germes qui res- tent dans le tissu des tubercules ne pourront évoluer qu'après avoir traversé une période de repos dans la terre. Ces faits ont été vérifiés de nombreuses fois avec des nodosités de Pois et de Fève en boutons, en Heurs ou en fruits. Ils pourraient faire supposer que les racines des Légumineuses ne constituent pas l'habitat naturel du microbe des nodosités, et qu'il n'y peut vivre indéliniment. Des observations analogues ont été faites pour la vie anaérobie de la Levure par M. Cochin. Une telle hypothèse ne serait pourtant pas justifiée, car le microbe des Légumineuses peut être propagé sur des pois pen- dant j)lusieurs mois, lorsqu'on a soin d'employer des nodosités très jeunes pour les inoculations successives. Formalion de races chez le microbe des nodosités. Non seulement la nature spécifique des plantes qui fournissent les nodosités inoculées retentit sur le nombre et les dimensions des tubercules chez le Pois, mais encore sur l'aspect des bactéroïdes. Comme M. Beyerinck l'a mis en évidence, l'aspect de ces corpuscules diffère sensiblement chez les diverses espèces de Légumineuses ; I I .NODOSITÉS DKS RACINES DE LÉCUMINEUSES. 121 leur grosseur est assez variable, leur forme laiilôt simple, tantôt plus ou moins ramiliée. Ces caractères sont assez cons- tants chez la même espèce; les exceptions qui se rencontrent dans la nature s'expliquent sans diflicullc de la manière suivante. Api es avoir habité une espèce, le microbe s'en ressent dans sa descendance, tout au moins pendant une génération. Voici qui le prouve. Un certain nombre de nodosités, dont il est question au tableau de ravant-dernière page, furent broyées et examinées au microscope. Les bactéroïdes, quoique développés sur le Pois, olhaient des dillerences assez sensibles pour un œil exercé. La fiiTure 2 en donne une idée assez exacte. ^it' tài li-i ^^K, v^^ '^^^ J) )) )> » » )) » » )i .) » )1 n )> 1 1 16 19 35 H )) » » 13 yi >) 1 1>I » ;. 3 8 9 17 2 » )j 2 <> M >» 9 (i )> » 3 IG 1 » ,i 4 4 )i » » » \ )> » » .1 W » » 2 )) » D 4 )) » » 42 14 56 » / li 1/ 3* 9* 14 14/ 5* 19 Total général 90 i. La colonne A comprend les personnes mordues par des animaux dont la rage est reconnue expérimentalement; la colonne B celles mordues par des ani- maux reconnus enragés à l'examen vétérinaire; la colonne C les personnes mordues par des animaux suspects de rage. Les animaux mordeurs ont été o fois; cheval, 1 fois ; vache 1 fois. chiens, 83 fois; chats, Le Gérant : G. 3Iasson. Sceaux. — Imprimerie Charaire et fils. w s-"' ANNEE. MARS 1891. N» 3 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR CONTRIBUTION A L'ETUDE DE LA VACCINATION CHARBONNEUSE Par M"» 0. METGHNIKOFF. L'étude de l'immunité en général peut tirer un grand secours de recherches sur l'immunité artificielle, parce qu'on connaît les facteurs de cette immunité; après avoir inoculé les vaccins qui servent à la conférer, on peut, en sacrifiant les animaux à diverses époques, étudier la suite des phénomènes qui accompa- gnent l'acquisition de l'état réfiactaire. Cette question a déjà été l'objet des recherches suivantes. ]\1M. Roux et Chamberland ' constatèrent, dans leur travail sur la vaccination des lapins contre le charbon, que les bactéri- dies du premier vaccin, injectées dans les veines, disparaissent très promptement du sang ; par contre, elles se conservent beaucoup plus longtemps dans la rate, qui donne des cultures encore 12, 24 et 48 heures après l'injection (et même dans un cas après 140 heures). Cette persistance de la bactéridie est attribuée à la présence de spores dans la culture inoculée, \. Annales de l'Instilat Pasteur, n" \\, 1887. 10 146 ANNALES DE L'LNSTITUT 1 ..UR. car, déjà 4 heures après l'injection, la majorité des bactéridies est englobée dans les cellules de la rate et se colore difficilement. Ainsi les bacilles du vaccin charbonneux ne pullulent pas dans l'organisme, et l'immunité relative quils lui confèrent pourrait être due à Tinlroduction des produits de leur culture, ou à ceux de leur destruction. M. Bitter ' a fait des expériences sur des moutons pour savoir si, à la suite d'une inoculation sous-cutanée du vaccin, il existait une immunité locale plus ou moins étendue ou, au contraire, une immunité générale. Il a aussi étudié la généralisation des vaccins dans l'organisme. Il résulte de ses observations que ces vaccins ne se généralisent pas (il n'a jamais pu obtenir de cul- tures, ni des organes, ni du sang), mais qu'ils sont détruits au point d'inoculation. Les ensemencements avec la peau et le tissu sous-culané en ce point ne donnèrent de culture qu'une seule fois sur cinq expériences. Quant aux préparations microscopiques, elles démontraient tonjours la présence d'une quantité plus ou moins grande de bacilles presque constamment libres et en voie de dégénérescence; ce n'est que rarement qu'ils étaient englobés dans les cellules, malgré une leucocytose très prononcée au point d'inoculation. Par suite, M. Bitter affirme que la destruction des bacilles n'est pas due aux éléments cellulaires. Du travail de M. Gamaléia'sur les vaccinations charbon- neuses, il résulterait que l'immunité contre le charbon n'est conférée qu'à la suite d'une fièvre vaccinale, pendant laquelle les bacilles se propagent du point d'inoculation dans le sang et dcins tous les organes; ils y sont détruits, et les débris de leur désa- grégation sont ensuite éliminés par les reins dans l'urine. Ces conclusions résultent de l'examen de préparations étalées, colorées par le bleu de méthylène, et d'ensemencements faits avec les organes. Ceux-ci ne donnaient que rarement des cultures, qui ne tuaient jamais les animaux et ne provoquaient même pas de symptômes morbides. Pour M. Gamaléia, la des- truction des bacilles ne s'opère que partiellement dans les cel- lules, notamment dans les macrophages de la rate, de la moelle des os et des autres organes; le plus souvent elle se produit ■I. Zeilsclirift fiir Hygiène, t. IV, 1888. "2. Annales de l'InsliUU Pasteur, n° 10, 1888. V.U:ClNATlâ\ CllAKBUNNEUSE. 147 hors des cellules. M. Gamaléia rattache le mécanisme de cette destruction des bacilles libres aux propriétés acquises des milieux de l'organisme dépourvus de cellules. Il ensemence des spores de bactéridies dans Thumeur aqueuse d'animaux ayant eu une fièvre vaccinale, et comme il n'obtient jamais ainsi de cultures normales, il conclut que le milieu a subi une modification chimique, et que la destruction des bactéridies est principalement due à un changement de même nature dans les milieux de l'organisme de l'animal vacciné. Ce changement serait provoqué par la fièvre vaccinale, pendant laquelle les leucocytes émigrés sécréteraient des produits chimiques, nuisibles au développe- ment des bactéridies. M. Wyssokovicz ' se rattache à l'opinion de MM. Roux et Chamberland sur la question de la vaccination par les produits des bacilles. Il croit que les bactéridies ne se propagent point dans l'organisme : il ne les a jamais vues ni dans les org-anes, ni dans le sang, ni dans l'urine, ni dans la bile. Quant au mode de leur destruction, il affirme que les leucocytes ne prennent jamais part à la lutte contre les microbes. De tous les éléments cellulaires, seules les cellules fixes détruisent les bacilles. M. Lubarsch ^ a fait des expériences sur des lapins et des moutons. Dans ses essais sur les lapins, il se bornait à chercher ce que deviennent les bacilles introduits sous la peau, ce qui ne se rapporte pas directement au sujet dont nous nous occupons. Sur deux moutons inoculés sous la peau avec des vaccins, M. Lubarsch n'a pas trouvé de généralisation des bacilles. Dans un cas il constata une phagocytose très prononcée au point d'ino- culation ; dans l'autre il ne rencontra que peu de phagocytes. Le but principal de ce travail est de rechercher si l'immu- nité contre le charbon est due à une g-énéralisation des vaccins, et d'étudier la réaction des éléments cellulaires envers eux. Si les bacilles des vaccins ne se propagent pas, il faut admettre avec MM. Roux et Chamberland que la vaccination est due aux produits de la culture injectée ou à ceux de la destruction des •1. Wratch, n°^ 2-2 et !2o, 1888, et Annales de l'Inslilut Pasteur, n» 6, 1889. 2. Kecherches sur les causes de l'immunité naturelle et acquise, 1891. . 148 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. bactéridies dans le corps des animaux. S'il y a généralisation, c'est à l'effet direct des bacilles eux-mêmes, ou aux produits qu'ils élaborent dans l'organisme, qu'il faut attribuer la vacci- nation. D'autre part, si les bactéridies sont extracellulaires dans les organes et au point d'inoculation, et si les ensemencements restent stériles dans les humeurs dépourvues de cellules chez les animaux vaccinés, il faut admettre avec M. Gamaléia l'in- fluence chimique des humeurs dans la destruction des vaccins. Dans le cas où les humeurs ne seraient pas devenues impropres à la culture, c'est surtout à l'activité phagocytaire des cellules qu'on devra attribuer la disparition des bactéridies vaccinales. I \m Les expériences ont été faites sur des moutons et des lapins. On employait des vaccins pastoriens en cultures dans du bouillon et ayant moins de 24 heures, afin qu'elles ne contiennent ni spores ni formes dégénérées qui auraient pu induire en erreur. Le contrôle de l'activité des vaccins était fait, avant les ino- culations, sur des souris, des cobayes et des lapins'. Les moutons que l'on employait pour les expériences étaient des mérinos de la province de Kerson, de la même race que ceux qui ont servi à M. Gamaléia. Il y en a eu dix, dont deux témoins. Tous, excepté un, furent inoculés par l/8ec du premier vaccin, qui avait tué une souris grise en 30 heures. Quelque temps avant l'inoculation, on prenait la température des moutons deux fois par jour. Elle oscillait entre 39,2 et 40,3. i*^"" VACCIN. Quatre moutons furent sacrifiés pour les recher- ches sur le premier vaccin. Comme il est peu probable que la généralisation s'opère dans un temps très court, ce n'est qu'après quinze heures que le premier mouton fut tué. Les autres 4. Les vaccins employés pour les moutons étaient ceux de la station bactério- logique d'Odessa, tandis que pour les la|)ins on avait dos vaccins de l'Institut Pasteur. L'effet vaccinal fut prouvé par un nombre considérable de lapins immu- nisés par les mêmes vaccins, et par la différence notable que présentèrent deux moutons témoins (un vacciné et l'autre non vacciné), vis-à-vis de l'inoculation du virus. Quoique ce dernier, d'origine ancienne, fut trop faible pour tuer le mou- ton non vacciné, il lui donna une maladie grave et de longue durée avec des températures s'élevant jusqu'à 42,3 (Voir la table des températures). Le témoin vacciné ne ressentit par contre aucun malaise, et ne présenta aucune élévation de température. I VACCINATION CHARBONNEUSE. 149 le furent après 24, 46 et 70 heures. La température de trois de ces moulons avait subi une certaine élévation (chez l'un d'eux elle était montée de 39,5 à 41,1), chez le quatrième elle était restée normale. (Voir V appendice.) Comme phénomènes locaux on n'a constaté qu'une lég-ère hypérémie du tissu sous-cutané. Une seule fois, chez le mouton tué après 46 heures, on a trouvé un œdème insignifiant. Tous les organes étaient complètement normaux. Ils furent ensemencés, ainsi que le sang, l'urine elle tissu sous-cutané au point d'inoculation. Ce dernier seul donna des cultures de bactéridies et seule- ment chez les moutons tués 15 et 24 heures après l'inoculation. Pour délinir la virulence de ces cultures, on inocula 1/8 de centimètre cube de celle du mouton, tué après 24 heures, à une souris grise. Elle succomba 5 jours après, avec fous les symp- tômes caractéristiques du charbon. Quant aux moutons sacrihés, les préparations étalées de leurs organes, de leur sang et de leur urine ne montraient, après coloration par le bleu de méthylène ou la méthode de Gram, ni bactéridies normales ou dégénérées ni de leurs débris. Le même fait fut constaté sur les coupes, colorées par la méthode de Gram. Les préparations faites avec le tissu sous-cutané du point d'inoculation démontrèrent une leucocylose très prononcée; les bactéridies y étaient en quantité plus ou moins grande. Sur les préparations étalées, faites après 15 et 24 heures, elles étaient fréquemment libres, mais il y en avait aussi dans les micro- phages qui étaient plus ou moins en voie de dégénérescence. Sur les coupes du tissu sous-cutané, faites après 46 heures, c'est-à-dire au moment où on a sacrifié l'animal, le tissu est complètement infiltré par des masses de leucocytes, qui ont englobé une quantité de bacilles plus grande que celle que l'on trouvait chez les moutons sacrifiés après 15 et 24 heures. Ce n'est qu'entre les faisceaux connectifs que l'on rencontre des bacilles et des filaments libres. Les bactéridies dégénérées sont contenues dans les cellules ; elles sont en forme de bâtonnets à bords rongés et en tronçons séparés ou en chapelets ; parfois elles ne se colorent que très mal. Comme il est facile de suivre tous les stades de dégénéres- cence depuis le bâtonnet normal jusqu'à ses derniers débris, il 150 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. est indubitable que c'est vraiment à des bacilles charbonneux dégénérés que l'on a affaire, et que leur destruction s'opère dans les cellules mêmes. Dans les préparations, faites par les mêmes procédés avec les organes, on ne voit rien de semblable, ce qui prouve que les organes ne contiennent pas en quantité appré- ciable de bacilles ou de leurs débris. Pour se rendre compte des changements chimiques, produits dans les humeurs par lafièvre vaccinale qui suit l'inoculation du l*"'vaccin, des ensemencements furentfaits dans l'humeur aqueuse du mouton qui avait eu une température de 41,1. Des spores du 2^ vaccin (sur fil de soie) germèrent dans ce milieu après 16 à 20 heures. Elles donnèrent des cultures abon- dantes et tout à fait normales. La dimension des bacilles était celle des bactéridies ordinaires du 2« vaccin, et ils prenaient très bien la matière colorante. 2* VACCIN. On inocula les cinq autres moutons, dont un témoin, avec le 2® vaccin. Le contrôle de la virulence fut fait sur des lapins russes qui, plus petits que les lapins de Paris, sont toujours tués par le 2® vaccin. Ils succombèrent après 60-63 heures, avec tous les symptômes du charbon, et des bactéridies dans le sang. Des quatre moutons employés pour les recherches sur le 2^ vaccin, le premier fut sacrifié après 18 heures; les autres, après 40, 63 et 87 heures. Ce n'est que chez le mouton tué après 40 heures qu'on a observé une élévation de température notable: 41,7. Chez les autres elle n'avait pas dépassé 39,5 — 39,9. Les moutons tués après 18 et 40 heures avaient une hypé- rémie du tissu sous-cutané au point d'inoculation; chez ceux qui furent sacrifiés plus tard, l'hypérémie était plus prononcée et il y avait en outre un œdème. Dans tous les cas les organes étaient normaux, excepté la rate qui fut trouvée plus molle et plus foncée chez les moutons tués après 63 et 87 heures. Des ensemencements furent faits avec le sang, Turine, les organes et le tissu sous-cutané au point d'inoculation. Seul ce dernier donna dans tous les cas des cultures char bonneuses caractéristiques. Quant aux organes, un seul ense- mencement de la rate du mouton tué après 40 heures donna une culture; tous les autres restèrent stériles ainsi que ceux du sang et de l'urine. Les cultures qui s'étaient développées conte- VACCINATION CKAIlBlJNNKUSb;. iol naient des bactéridies tout h fait normales dans leur croissance, leur dimension, et dans la façon dont elles se coloraient. Pour définir leur virulence, on les inocula à des lapins. ]Ji\ huitième de centimètre cube de culture de la rate du mouton (sacrifié après 40 heures) inoculé sous la peau d'un lapin le tua après 47 heures. Le tissu sous-cutané de l'abdomen du lapin était très œdémateux. Il et le sang- contenait une petite quantité de bactéridies caracté- ristiques. On peut conclure de cette expérience que les bacilles parve- nus dans la rate étaient virulents. C'est pour cela sans doute qu'ils avaient pu échapper à l'action cellulaire au point d'ino- culation, et pénétrer jusque dans cet organe. D'autres lapins furent inoculés avec des cultures obtenues du tissu sous-culané des moutons tués après 40, 63 et 87 heures. Les lapins qui reçurent les deux premières cultures (de 40 h. et 63 h.) furent très malades, eurent de gros œdèmes, mais finirent par se rétablir. Le troisième lapin (de 87 h.) succomba après trois jours avec tous les symptômes caractéristiques du charbon et avec une quantité de bacilles dans le sang". Peut-être la virulence de ces cultures était-elle moindre que celle du vac- cin inoculé: sur les préparations du tissu cellulaire du point inoculé, on voit que déjà après 40 heures la majorité des bacilles est englobée dans les microphages, et qu'il n'y a que très peu de bactéridies libres et normales ; la plupart sont au contraire en voie de dégénérescence et dans l'intérieur des cellules. Les coupes démontrent que tout le tissu au point d'inoculation est infiltré de leucocytes. Il se peut donc que les bacilles soient affaiblis, quoique encore en étal de donner des cultures. Sur les préparations faites avec les organes, le sang et l'urine, on ne trouvait nulle part de bacilles soit normaux, soit dégé- nérés. Même sur les coupes faites avec la rate qui avait donné une culture, on n'a pas réussi à en trouver, ce qui prouve que la quantité des bactéridies y était bien petite. Quant aux expériences sur la germination des spores dans l'humeur aqueuse de l'animal fébricitant, elles donnèrent les mêmes résultats que celles faites avec le l*^'' vaccin. Des spoi^es du !'''■ et du 2" vaccin, et aussi du charbon virulent germèrent dans l'humeur aqueuse du mouton qui avait eu une température I 152 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. de 41,7. Elles se développèrent toutes le lendemain de Tense- mencement. Leur croissance était abondante et caractéristique ; les bactéridies étaient en forme de bâtonnets et de long-s filaments tout à fait normaux. De ce qui précède on peut tirer les conclusions suivantes : Chez les moutons, les deux vaccins provoquent des phénomènes locaux et opèrent leur elTet à cause de leur culture locale ; les bactéridies ne pullulent point dans l'organisme, mais sont dé- truites sur place par les éléments cellulaires, surtout les leuco- cytes ; la pénétration des bacilles dans les organes est un phé- nomène rare, ne pouvant avoir par suite d'importance dans la vaccination del'animal. Enfin leshumeurs, dépourvuesdecellules, des animaux vaccinés, ne contiennent pas de produits nuisibles au développement des bactéridies. 111 Les résultats des expériences faites sur les lapins ' concor- dent en général avec ceux qui viennent d'être exposés. 1" VACCIN. Le mode d'inoculation du premier vaccin est très favorable à l'étude des relations entre les cellules et les bacilles, puisque ces derniers sont introduits directement dans le système sanguin. On a sacrifié les lapins 30 minutes, 45 minutes, 1 heure, 2 heures, 3 heures, 3 heures 1/2, 4, 6, 24 et 48 heures après l'inoculation. Le sang, l'urine et les organes étaient examinés et ensemencés. Les bacilles disparaissent très promptement du sang, comme cela a été décrit par MM. Roux et Chamberland. Déjà une demi- heure après l'injection il y en a très peu et, au bout d'une heure, on ne parvient plus à les trouver ni par un examen microsco- pique, ni par la culture. On n'observe point de bacilles dans l'urine. Déjà une demi-heure après l'injection, on trouve la ma- 4 4. Les expériences élaient faites sur des lapins français et on employait les vaccins ordinaires. On inoculait 3j'" du \'''' vaccin dans la veine de l'oreille. Chez trois des lapins sncrifiés [lour les expéiiL-nces sur le "2' vaccin, on a injecté une quantité plus faible, de 5 ù 2o'"'', parce que le vaccin avait été renforcé. — On inoculait U,;2l)^>= du second sous la peau, 7 jours après la seconde inoculation du l*-'' vaccin. l 1 VACCINATION CHAIIBONNEUSE. 153 jorité des bactéridies englobée dans les microphages principale- ment, mais aussi dans les macrophages. C'est surtout dans les poumons qu'on trouve une quantité de bacilles; cela s'explique peut-être parce que, étant introduits dans le système veineux, ils parviennent premièrement dans le poumon et y sont retenus en partie. Dansions les organes, lamajoritédes bacilles est englobée parles cellules; on rencontre des formes plus ou moins dégé- nérées, mais il y a encore des bâtonnets libres et complètement normaux. C'est dans les reins que les bacilles sont le moins nombreux; il est exceptionnel d'en rencontrer. Tous les ensemencements faits avec les organes 45 mi- nutes, 1 et 2 heures après l'inoculation, donnèrent des cultures. Sur les préparations, on pouvait observer les mêmes phénomènes qu'après une demi-heure, avec cette différence que le nombre des bactéridies englobées dans les microphages et macrophages était d'autant plus grand que l'animal avaitété sacrifié plus long- temps après l'inoculation; alors la grande majorité des bacilles était dégénérée, il y en avait très peu de libres et normaux. Déjà, après trois quarts d'heure, les bacilles sont beaucoup plus rares dans les organes que dans la première demi-heure qui suit l'injection. La virulence des cultures faites avec les organes est éprouvée en inoculant à une souris blanche la culture de la rate d'un lapin, tué une h.eure après l'inoculation. Elle succomba le 7® jour. Avant de périr, il semble donc que les bacilles du l" vaccin subissent une diminution dans leur virulence. Les organes d'un lapin tué après 3 heures servirent à faire des ensemencements multipliés; la rate seule donna une culture, et seulement trois jours après l'ensemencement. Une souris, inoculée par cette culture, résista. Trois heures et demie après l'inoculation, les ensemen- cements des organes ne donnèrent plus de cultures. Sur les pré- parations étalées et sur les coupes, on trouvait tous les bacilles englobés dans les microphages et macrophages et en voie de dégénérescence plus ou moins avancée. Aucun des ensemencements faits avec les organes d'ani- maux inoculés depuis plus longtemps, ne donna de cultures. On n'a pu davantage trouver de bactéridies sur les préparations. Ces expériences prouvent que les bacilles du l*'"" vaccin ne 154 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. pullulent point dans l'organisme, mais y sont détruits par les cellules dans un temps très court, notamment près de 3 heures 1/2 après l'injection. Df.uxikme inoculation du !•" VACCIN. A. quatre lapins, qui avaient déjà reçu le l<"' vaccin, on injecta une dose de 35'='' du même vaccin, ainsi que cela se pratique quand on veut donner l'immunité à ces animaux. Ils furent sacrifiés 1,2,3 et G heures après cette seconde inoculation. Les ensemencements des organes du lapin, tué une heure après l'inoculalion, donnèrent tous des cultures normales et caractéristiques; le sang et l'urine restèrent stériles. Sur les coupes on trouvait la majorité des bacilles plus ou moins dégé- nérés et englobés dans les microphages et macrophages. De tous les organes du lapin tué après 2 heures, les pou- mons et les reins fournirent seuls des cultures. Sur les coupes on a pu constater que presque tous les bacilles étaient dégé- nérés et englobés dans les microphages et macrophages; on n'en trouvait que très rarement de libres. Le rein du lapin tué 3 heures après l'inoculation fut le seul organe qui donna une culture. Chez les animaux sacrifiés après 6 heures, tous les organes ensemencés restèrent stériles. Ainsi on obtient les mêmes résultats avec le 1er vaccin inoculé une deuxième fois; la seule différence consiste, peut- être, en ce que les phénomènes de destruction des bacilles se produisent un peu plus promptement : déjà 2 heures après l'inoculation, une partie seulement des organes donne des cul- tures. Ce fait peut être expliqué par l'accoutumance partielle de l'organisme au l®"" vaccin. 2® VACCIN. Pour l'étude des phénomènes produits chez les lapins par le 2" vaccin, on a inoculé ces animaux sous la peau avec 0''%25 de ce vaccin, 7 jours après qu'ils avaient reçu dans la veine les deux injections préparatoires du 1^'' vaccin. Ils ont été sacrifiés à des temps variables après l'inoculation; le premier à partir de la 6^ heure, car il n'est pas probable que la généralisation se produise plus tôt. Les vaccins employés tuaient les souris et les cobayes. I I VACCINAïrON CIIARBONNKIISE. 155 Les ensemencements faits avec le sang, l'urine et les or- ganes du lapin tué 6 heures après l'inoculation, restèrent tous stériles. Deux lapins furent tués 12 heures après l'inoculation. Leur sang" et leurs organes ne donnèrent point de cultures. On ensemença le tissu sous-cutané pris au point d'inocula- tion d'un de ces lapins; il donna une culture qui fut inoculée à un cobaye. Celui-ci résista. Les ensemencements faits avec le sang et les organes d'un lapin tué 21 heures après l'inoculation restèrent stériles. Deux lapins furent sacrifiés après 24 heures. La rate de l'un et le rein de l'autre donnèrent des cultures. On inocula deux cobayes avec la dernière de ces cultures. L'un d'eux résista, l'autre succomba après trois jours, avec les symptômes carac- téristiques du charbon. Ainsi on retrouve un affaiblissement de la virulence comme chez le mouton, car les cobayes de contrôle qui recevaient directement le 2'' vaccin employé, mouraient au plus tard 40 heures après l'inoculation. Le sang- et les organes de ces deux lapins restèrent stériles. Il en fut de même pour le sang-, l'urine et tous les organes du lapin tué 41 heures après l'inoculation. Chez l'un des deux lapins, tués 42 heures après l'inoculation, le sang-, l'urine et tous les organes restèrent stériles; chez l'autre on obtint une culture avec le rein; les autres organes et le sang- n'en donnèrent point. 48 heures après l'inoculation, des ensemencements multipliés restèrent stériles. Ainsi sur les dix expériences faites avec le 2*^ vaccin chez les lapins, ce n'est que dans trois cas que l'on obtint des cultures tantôt d'un organe, tantôt d'un autre : encore dans ces cas, sur plusieurs ensemencements, un seul se montrait fécoud. Tout cela démontre que les bacilles du 2e vaccin ne se ré- pandent que rarement en dehors du point d'inoculation. Quant aux préparations étalées (colorées par la méthode Gram et le bleu de méthylène) dusang-, de l'urine et delà pulpe de la rate, des poumons, du foie et des reins, elles ne démontrè- rent ni bactéridies normales, ni bactéridies dégénérées, ni leurs débris. L'examen des coupes donna les mêmes résultats. 156 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. Les faits, observés dans Je courant de ce travail, permettent de tirer les conclusions suivantes : Les bacilles du vaccin charbonneux produisent leur eiïet en se cultivant au point dinoculation, sans se propager nécessaire- ment dans l'organisme ; ils ne pénètrent qu'exceptionnellement et à un faible degré dans les organes. La vaccination est donc due aux produits des bacilles, qui se diffusent du point d'inocula- tion dans l'organisme. La destruction des bacilles a lieu au point d'inoculation et s'opère par l'activité phagocytaire des micro- et macrophages. La vaccination consiste sans doute dans l'accoutumance des éléments cellulaires aux produits toxiques des bacilles. Cette dernière conclusion est appuyée sur le fait que, chez l'animal vacciné, les vaccins et le virus se développent normalement dans l'humeur aqueuse, dépourvue de cellules, tandis qu'ils sont détruits dans l'org-anisme où ils devien- nent accessibles à TinOuence de ces dernièivs. APPENDICE Température des moutons avant les inoculations. 15 AOUT 17 AOUT 18 AOUT NUMÉROS. ' ■ ^_ ^ ^^ lÛ H. M. 6 H. s. 10 H. M. 6 H. s. 10 H. M. 6 H. s. 1 39.6 40.3 •iO 40.1 39.4 39.6 2 39.7 40.0 39.8 40.0 40.0 39.3 3 39.8 40.2 39.8 40.0 39.4 39.5 4 40.1 40.2 39.9 40.0 40.0 39.2 5 39.4 -39.0 39.3 39.7 39.3 39.5 6 39.5 3!l . 9 39.8 40.3 40.0 39.8 7 39.6 40.0 39.4 39.9 3!». 9 39.5 8 39.0 40.4 39.3 39.9 39.7 39.5 9 39.9 40.3 39.7 40.1 39.8 39.8 10 39.3 40.5 39.0 40.1 39.8 39.9 VACCINATION CHARBONNEUSE. 157 Température des moutons après le premier vaccin. 19 AOUT. 20 AOUT. 21 AOUT. 27 aoiit. 28 AOUT. » NUHÉnua. 1 II H . M . 5 H. s. 10 H. M. 4 H. s. 10 H. M. i H. S. 10 H. M. 10 II. M. '.') H, S. 1.. 2.. 3.. 4.. 5. 6.. 7.. 8.. 9.. 10.. 39.5 39.2 39.2 39.8 39.4 39.7 40.6 30.3 39.8 39.7 39.7 39.7 39.9 41.1 3'i.8 40.0 » 39. S 39.7 39.7 39.5 39.0 39.5 » 39 2 39.6 39^6 39.2 39.4 39.4 39.2 39.7 » 39.2 39.6 » 39.4 39.7 39.4 39.1 39.1 39.4 38.9 39 4 » 39 "3 39.5 39.3 39.1 39.4 39.2 39.6 » 39.4 39.6 39.7 38.7 39.0 » 39.3 39 » 39.5 » 40.1 39.3 40.5 39.6 39.8 » 39.4 40.1 39.4 39.3 » 39.4 39.3 ») )) 39.9 » )t )> » » » » » Température des moutons après le second vaccin. NUMÉROS. 29 AOUT. 30 AOUT. 31 AOUT. i"sept. 7 sept. 9 H. M. 11 H. M. 9 H. M. ") H. S. 9 H. M. 5 H. S. 9 H. .M. 9 H. M. 1 38.8 » 41.7 ■I) » » » » » » 2 39.5 » 39.0 39-3 39.3 « )) » » » 3 » » D » » » 39.2 39.2 » » 5 39.4 » 39.7 39.8 39.4 39.7 39.5 39.8 » » 6 39.7 » 39 2 39 9 39.4 39.7 39.5 » » » 9 39.7 39.5 » » )) » » » » » Température des témoins après l'inoculation du virus. NUMÉROS. 7 sept. 8 SEPTEMBRE. 9 SEPTEMBRE. 10 SEPTEMBRE. 14 SEPTEMBRE. 10 sept. 7 H. s. 9 H. M. 5 H. S. 9 H. M. .5 H. S. 8 H. M. 6 H. s. 10 H. M. 5 H. ^. 1 1 H. M 3 5 40.5 39.5 41.2 39.2 41.9 39.1 42.2 39.1 42.3 39.1 41.8 39.8 42.1 39.5 41.7 39.2 41 . 1 39.6 39.8 39.2 SUR UN RÉGULATEUR DE TEMPÉRATURE APPLICABLE ALX ÉTUVES Par m. roux. Les étuves à température constcaote sont indispensables aux bactériologistes : aussi a-t-on imaginé un grand nombre de ré- gulateurs de température applicables à ces appareils. Il y en a d'excellents qui ont fait leurs preuves. Cependant nous croyons rendre service aux travailleurs en leur faisant connaître un régu- lateur robuste, simple en même temps que précis, et qui fonc- tionne depuis plusieurs années à l'Institut Pasteur sans avoir nécessité de réparation. Ce régulateur est formé de deux barres métalliques, l'une en acier, l'autre en zinc, soudées ensemble sur toute leur longueur et recourbées ensuite en forme d'U. Le métal le plus dilatable, le zinc, étant en dehors, toute élé- vation dans la température tendra à rapprocher les branches et tout abaissement les écartera l'une de l'autre. Pour une variation donnée de température, le mouvement des branches de ru sera d'autant plus étendu que les coefficients de dilatation des deux métaux soudés ensemble seront plus différents ; c'est pour cette raison que l'on a réuni le fer et le zinc. Il faut que les barres métalliques soient assez fortes pour ne pas faire pincettes, c'est-à-dire que leurs extrémités doivent rester bien rigides et ne pas se rapprocher d'une façon sensible quand on les serre entre les mains. La réunion de deux métaux de dilatation iné- gale permet, avec des barres de longueur modérée, d'avoir un déplacement assez étendu . Ces régulateurs bi-métalli- qnes ont été souvent employés, notamment par M. Schaffer, processeur de physiologie à University Collège. Il y a diverses façons d'utiliser le mouvement des branches pour régler le débit du gaz qui se rend au brûleur de l'étuvc Ou peut faire écraser le tube de caoutchouc conduisant le gaz entre les deux branches métalliques qui se rapprochent par l'échauffé- IIKGLLATEUR APPLICABLE AUX ETUVES. 159 ment et diminuer ainsi la tlamme. On peut encore fixer une des branches de façon qu'elle soit immobile, et ajuster à l'autre une lige qui suivra ses mouvements et ira ouvrir ou obstruer l'arrivée du i^az combustible. Les mouvements dus à la dilatation du régulateur bi-métallique peuvent être amplifiés au moyen de leviers, et on augmenle ainsi la sensibilité de l'ajjpareil. Fig. Ce régulateur est adapté aux étuves du modèle Pasteur cons- truites par M. AYiesnegg', qui sont très employées dans les labora- toires de microbie (fig. l) ; elles sont en effet assez vastes sans être 160 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. encombrantes. Depuis que M. Schribaux a remplacé le chauf- fage à vapeur par le chauffage direct au gaz, elles sont devenues plus commodes encore et consomment très peu de gaz. Le régu- lateur est placé verticalement près d'une paroi latérale, l'ouver- ture de ru vers le haut : une des branches A (fig. 2), la plus éloignée de la paroi, est fixée à l'éluve, l'autre, qui seule peut se déplacer, porte une tige horizontale qui sort de l'éluve par une ouverture suffisante pour qu'elle puisse sV mouvoir librement. A sa sortie de l'éluve, cette tige est recourbée à angle droit et traversée par une vis/?, qui peut être fixée à un point quelconque de sa course au moyen d'un écrou e. L'extrémité de celle vis peut être amenée au contact d'une petite soupape qui commande l'écoulement du gaz et qui complète l'appareil. Cette soupape 0, est formée par un obturateur conique, en .ai ton, fixé sur une tige qui traverse le tube d'arrivée du gaz. Un petit Fig. 2. ressort, placé dans ce tube même, maintient l'orifice de sortie fermé tantque l'on n'appuiepas sur l'extrémité de la tige de l'obtu- rateur, mais si celle-ci est légèrement repoussée, le tube est ouvert, le gaz se répand dans la petite chambre en verre r, et se rend au brûleur par une tubulure. Une petite ouverture, prati- quée dans l'obturateur, laisse passer assez de gaz pour main- tenir la flamme du brûleur en veilleuse quand la soupape est fermée. Cet obturateur joue donc le rôle d'un robinet sensible et facile à ouvrir au moyen d'un mouvement en ligne droite et HÉGULATEUll APPLICAHLK AUX ÉTUVES. 161 II peu éteiiclu. H est lixé à la paroi extérieure de Tétuve en face de la ti^e du régulateur et à peu de distance d'elle, de façon qu'il soit actionné par elle quand on amène la vis à son contact. Un coup d'œil jeté sur la ligure ci-jointe fera mieux comprendre le jeu de l'appareil que les détails que nous pourrions ajouter. Les choses étant ainsi disposées, pour régler l'étuve, on tourne la vis jusqu'à ce que, pressant sur l'extrémité de la tige, elle ouvre largement la soupape et on allume le brûleur. Lorsque le thermomètre placé dans l'étuve marque à moins de 1/2 degré la température que l'on veut atteindre, on tourne la vis jusqu'à ce qu'elle affleure l'extrémité de la tige. L'étuve est alors réglée; en eflet, si elle se refroidit, les branches du régulateur s'écartent, et la vis appuyant de nouveau sur la tige, ouvre l'arrivée du gaz. Le fonctionnement est très régulier ainsi que le montre le tracé du thermomètre enregistreur (fig. 3). Les grandes oscil- Fig. 3. lations marquent les ouvertures de l'étuve, mais on voit qu'en marche régulière récartjmaximum ne dépasse pas un demi-degré. Chaque étage de l'étuve a une température spéciale, mais constante. Cet appareil, tout à fait robuste, peut être porté à de hautes températures. Avec quelques modifications il peut être employé à régler une étuve chauffée au pétrole ou à l'alcool. Pour l'empê- cher de se rouiller dans un milieu humide, on le recouvre d'une couche de noir mat, La température est très constante avec les deux modèles d'étuve que M. AYiesnegg a munis de ce régulateur. Dans les étuves de dimensions plus petites, le fonctionnement est moins bon parce que le volume d'air est trop petit pour le régulateur, qui 11 162 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. doit avoir une certaine masse si l'on veut lui conserver sa rigi- dité et sa sensibilité. Pour que la température se maintienne au même degré, il est nécessaire qu'il se fasse un renouvellement lent de l'air: on rénlise cette condition au moyen des ventouses dont l'éluve est munie. De même que le mouvement de la branche mobile du régu- lateur ouvre et ferme l'arrivée du gaz, de même elle peut régler le débit d'un courant d'eau, qui refroidira l'étuve en passant dans des tubes de plomb disposés dans son intérieur. Le même appa- reil peut être un régulateur de froid comme un régulateur de chaleur. En été il est très commode, pour les cultures en gélatine, d'avoir une armoire maintenue ainsi à une température de 23*' par un courant d'eau. Le régulateur bi-métallique rend la chose facile. I I I RECnERCDES SIR II DI(ÎEÏÏIO\ IXTIUCEIJXLURE CHEZ LES PROTOZOAIRES (2« partie) Par Félix LE DANTEG. (Travail du laboratoire de M. Metclinikoff, à l'Institut Pasteur.) Dans une première note', j'ai exposé les divers résultats que l'emploi de l'alizarine sulfoconjusuée permet d'obtenir chez les Rhizopodes ; ce réactif donne ég^alement des renseignements précieux sur la digestion intracellulaire chez les Lifusoires ciliés, et démontre chez les animaux de ce groupe l'existence de phé- nomènes de même genre, et même plus intenses. Le tournesol nous a donné de mauvais résultats quand nous l'avons employé pour l'étude des Péritriches; au contraire, l'ali- zarine ^ulfoconjiiguée est très avantageuse pour h^s recherches sur ce groupe dont je prends comme type un genre colonial à pied ramifié rétraclile, le Carchesium. Un rameau détaché d'une colonie de ces êtres continue à vivre dans les condilions nor- males, et c'est toujours avec des petits groupes de quatre à cinq individus qu'il convient de faire les préparations. En disposant en goutte suspendue un de ces groupes avec un peu d'alizarine violette, on peut avoir deux résultats différents suivant les cas. Le premier cas est celui où les animaux étudiés ont été pris dans un bocal très riche en substances nutritives; alors chaque individu est opaque et bourré de vacuoles, et l'on peut attendre très longtemps sans assister à ringeslioii d'un gruin<'au d'aliza- rine, quoique le mouvement ciliaire continue a agiter l'eau à 1. Annales /»., 1891. 4. Ibid. nû 7, p. ;284, et Tkierarzllichc Mitlheilungcn, 1891. o. Comptes rendus de la Société de biologie, 1891, n° ~, p. 13'2. 192 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. biologie, M. Capitan' ajouta que, dans ses expériences, un singe tuber- culeux ne manifesta aucune réaction après trois closes de 1 milli- gramme, tandis qu'un autre singe, supposé tuberculeux, ne réagit qu'à 4 milligrammes de tuberculine. Ces recherches, si intéressantes sur la tuberculose du singe, promettent de donner des résultats impor- tants lorsqu'elles seront menées à bout. IV D'après M, Koch, l'homme sain ou atteint d'autres maladies que la tuberculose ne commence à réagir par une faible élévation de tempé- rature et la courbature qu'à des doses de 0,01 c. c, tandis que les tuber- culeux donnent une réaction assez prononcée déjà après une injection de 0,001 c. c. Cette différence de la réaction pourrait donc rendre de grands services pour le diagnostic. Beaucoup d'observations dirigées vers ce point prouvèrent qu'en réalité, dans le plus grand nombre des cas, les tuberculeux réagissent beaucoup plus sûrement et fortement, et à des doses beaucoup moindres que les non tuberculeux. Cependant, il a été bien démontré aussi que cette règle, quoique générale, est loin d'être absolue. D'abord, il y a un nombre considérable de tuberculeux avérés, chez lesquels la tuberculine ne provoque point ou presque point de réaction. Ce sont surtout des cas de tul)erculose pulmonaire avancée qui présentent cette exception. Parmi les exemples de phtisie moyenne ne donnant pas de réaction, le plus remarquable est celui qui a été rapporté par M. Senator^ Il concerne une jeune dame chez laquelle 25 injections, dont 6 avec des doses de 0,02 c. c. ne provoquèrent aucune élévation de température; même, celle de 37°, 5 ne fut jamais atteinte. D'un autre côté des personnes bien portantes, ou atteintes de mala- dies autres que la tuberculose, réagissent quelquefois d'une façon assez intense à des doses bieu au-dessous de celle de 0,01 c. c, indiquée par M. Koch comme limite inférieure. Dans les cas observés par M. Peipor % parmi 19 personnes non tuberculeuses qui reçurent 0,002c. c, quatre présentèrent de la fièvre et une réaction générale suffisamment accusée. Peut-être que, dans quelques-unes de ces exceptions, il s'agit d'une tuberculose latente qui ne put être révélée par aucun moyen dia- gnostic. Tel fut un cas de M. Schreiber*, où un malade, ne présen- 1. ibiiL, p. i;'.:}. 2. Bcrlincr Klin. Woch., 1831, n^ 7, p. 163 3. JJeutsclie med. Woch., 1891, u° 4, p. lliO. 4. Jbid., no 8, j). 308. REVUES ET ANALYSES. 193 tant aucun sii^ne de tuberculose et chez lequel on supposa une neu- rasthonie, donna une réaction caractcrislique après chaque injection; après la septième il rejeta un peu de crachats, dans lesquels furent trouvés des bacilles tuberculeux. Contre la supposition que dans toutes les exceptions à, la règle, il s'agit toujours d'une tuberculose latente, il y a les élévations de température observées chez des cobayes notoi- rement sains après des injections de tuberculinc, ainsi que des exemples de réaction locale et d'amélioration chez des malades non tuberculeux. Le cas le plus intéressant de ce genre est celui qui a été rapporté par M. Billroth'. et dans lequel 15 injections de tuberculine ame- nèrent le ramollissement d'une infiltration actinomycotique et la gué- rison de la maladie. M. Pciper(/. c.,p. 164) cite également un malade atteint de cystite consécutive à une gonorrhée, qui réagit promptc- menl aux injections (jusqu'à 0,02.--), et chez lequel la tuberculine occasionna une amélioration surprenante dans l'état local. Les lépreux manifestent aussi une réaction à la tuberculine, qui quelquefois amène chez eux des améliorations sensibles (Goldschmidt, Babes et Kilendero, etc.). Malgré toutes ces exceptions, la règle générale persiste, de sorte qu'il est incontestable que, dans beaucoup d'occasions, la tuberculine peut rendre des services importants. Ainsi, les injections de ce liquide ont permis à M. Schreiber (/. c, p. 308), de constater que des enfants issus de parents tuberculeux sont déjà atteints d'une tuberculose locale, notamment de ganglions, dans une période où leur état de santé ne laisse rien à désirer. D'un autre côté, le même observateur a établi que les nouveau-nés (dont il a examiné 40), sont exlraordi- nairement insensibles à la tuberculine; même des doses allant jusqu'à 0,05'=% ne produisent chez eux aucune trace de réaction. Ce fait remar- quable démontre que la tuberculose congénitale n'est pas la règle, et que ce n'est qu'à un certain âge que les enfants acquièrent la maladie. En parlant de l'effet de son remède sur l'homme, M. Koch insiste pour que l'on commence, autant que possible, les recherches par le traitement des lupus. De très nombreux observateurs ont confirmé l'exactitude de la description de la réaction locale, faite par M. Koch dans les termes suivants : « Quelques heures après l'injection faite 1. Wiener mcdicinischc Presse, 1891, u'^ 0, p. 330. lu 194 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. sous la peau du dos, c'est-à-dire en un point bien éloigné des parties atteintes, les régions lupeuses commencent — d'ordinaire même avant la manifestation du frisson — à gonflei' et à rougir. Pendant la lièvre, le gonflement et la rougeur augmentent de plus en plus, et cet état arrive même au point que le tissu lupeux présente une couleur brun- rouge et devient nécrotique. Si les foyers lupeux sont plus limités, on voit que la région, fortement tuméfiée et d'un brun-rouge, est entou- rée d'une auréole blanchâtre d'une largeur de près de 1 centimètre, qui à son tour est entourée d'une zone rouge vif. Après l'abaissement de la température, la tuméfaction des régions lupeuses diminue peu à peu, de telle sorte qu'elle peut avoir disparu au bout de 2 ou 3 jours. Les foyers lupeux eux-mêmes sont couverts de croûtes formées d'un sérum s'écoulant en gouttes et se séchant à l'air; elles se trans- forment en escarres qui se détachent spontanément au bout de 2 à 3 semaines, et présentent, parfois déjà après une seule injection du liquide, une cicatrice lisse et rouge. En général, il faut cependant plusieurs injections pour obtenir ce résultat. Un point à noter, c'est que dans ce processus les altérations décrites sont exclusivement limitées aux régions atteintes de lupus; les plus petites nodosités, presque invisibles et cachées dans le tissu cicatriciel, prennent même part à ce processus et deviennent visibles par suite du gonflement et du changement de couleur, tandis que le tissu cicatriciel proprement dit, dans lequel les processus lupeux se sont terminés, ne subit aucun changement. » (2'"« Mémoire de M. Koch.) Ce tableau typique a pu être observé après des doses de 0,01 c. c, qu'on injectait aux lupiques adultes dans les premiers cas étudiés par M. Koch et un grand nombre d'autres observateurs. Les exemples de lupus véritable ne présentant pas de réaction après les injections sont extrêmement rares. Je ne citerai qu'un cas des plus marqués. M. J. Israël ' a observé un malade lupique, atteint en même temps d'une tuberculose pulmonaire, qui, malgré des doses allant jusqu'àO,! ce. et malgré une quantité totale de 0,896 c. c. detuberculine injectée, ne manifesta ni réaction locale, ni amélioration de l'affection lupeuse. Néanmoins, l'examen microscopique d'un morceau excisé démontra la présence de tubercules et de cellules géantes typiques. Même en se servant de doses beaucoup plus faibles, comme on le fait maintenant, afin d'éviter les accidents, on obtient une réaction assez marquée et quelquefois même très forte. Ainsi M. Blaschko^ ol)tint une réaction locale très prononcée après avoir injecté des 1. Berliiier klinische Wochenschr., 1S9I, n'^ i, d. 111!. -2. Ibiil., ti" », p. t>oM. l UEVUES ET AiNALYSKS. li)5 iloscs de 2 (.léci-milligrammes. M. H;illopeaii ' a conslalé (jiruii dcmi- millième de c. c. suffit souvent à élever la température à plus de 40'^; chez plusieurs sujets il a obtenu une réaction suffisante même avec un quart de millième. Tous les observateurs sont unanimes à reconnaître l'amélioralion produite par la tuberculine dans beaucoup de cas de lupus. Quelque- fois même on a pu constater une guérison, qui s'est maintenue pen- dant un temps assez long. Ainsi M. Esmarch - a obtenu une guérison délinilive dans un cas de lupus du nez, compliqué d'excroissances adé- noïdes de la cavité nasopharyngienne, avec suppression totale de la respiration nasale. Une quantité totale de tuberculine de 0,86 c. c. a suffi pour faire complètement disparaître le lupus et pour rétablir la respi- ration par le nez. Tout récemment, M. Billrolh '^ a mentionné la dispa- rition totale d'une infiltration lupique de la lèvre supérieure après un traitement de trois semaines par la tuberculine. Les lupiques qui ont été le plus longtemps observés sont les trois malades de M. Levy *, dont le traitement fut commencé en octobre 1890, sous la direction de M. Koch même. Les doses employées étaient parmi les plus grandes qui aient été administrées (jusqu'à une quantité totale de 2,0 gr.), et la réaction était des plus prononcées. Dans ces conditions, l'amélioration a été très frappante et nette. Malheureusement, depuis la première communication du mois de novembre 1890, M. Levy n'a point donné de renseignements nouveaux sur le sort de ses malades, et ce n'est que par voie indirecte que nous apprenons^ que l'un d'eux a donné une récidive après la dixième injection. Sous ce rapport on est mieux informé sur la marche du traitement des malades lupiques de M. Bergmann •', dont le traitement a été com- raencé au mois de novembre dernier, et chez lesquels par conséquent la période d'observation a été des plus longues. Parmi les premiers malades, l'attention fut surtout attirée sur un nommé Klingbeil, atteint de lupus exfoliatif et exulcerant du nez, des joues et de la lèvre supé- rieure, avec disparition de la cloison et des ailes du nez. Les injections de 0,01 c. c. de tuberculine furent suivies d'une réaction intense, et l'amélioration, après la quantité totale de 0,05 c. c, fut telle que M. Bergmann exprima « l'assurance certaine que mêmes les dernières traces de la maladie, consistant en exfoliation et rougeur, disparaî- i. Semaine médicale, 1891, n" S, p. oD. -1. Deutsche medic. Wochensch., 1891, nos a et 4, p. 103 et 17-2. 3. Wiener medicin. Presse, 1891, n" 9, p. 3ol. i. beat. mcd. Wocli., 1890, n° 47, p. lOoO. o. Wiener medic. Presse, 1890, n" 30, p. 1993. 6. Deutsche medic. Wac/i., 1890, n" 87, p. 107;-!. 196 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. Iraient prochainement ». Le traitement fut poursuivi ' jusqu'au 8 jan- vier 1891, s'étendant ainsi à 53 jours; la quantité totale de la tuber- culine s'éleva à 0,87 c. c. Mais, malgré la disparition des réactions et l'amélioration mentionnée, la réaction générale et locale réapparut, plus de deux mois après le commencement du traitement, à un tel degré qu'il se forma de nouvelles croûtes. JjCS mêmes phénomènes furent notés dans beaucoup d'autres cas de lupus, de sorte que la plupart des observateurs ne parlent plus de guérisons définitives, et mentionnent souvent la réapparition de tubercules lupiques sur les endroits qui paraissaient être guéris. Ainsi M. Hulchinson - a vu, malgré la réaction caractéristique et une amélioration incontestable, des résidus de tuber- cules persister sur les bords de la peau aiïectée, et constata une telle récidive dans un cas, considéré d'abord comme guéri, que l'amélioration était nulle. M. Schwimmer^ à Budapest, résumant ses observations sur le trai- tement du lupus, affirme que malgré des améliorations notables, la guérison définitive ne put être obtenue, parce que les tubercules pro- fonds, résidant dans le derme, restèrent intacts après le traitement. Les dermatologistes de l'hôpital de Saint-Louis, MM. Besnier et Haliopeau % qui entreprirent le traitement sur plusieurs dizaines de malades, mais opérèrent avec des doses beaucoup moindres que celles employées en Allemagne, remarquèrent que non seulement les tubercules anciens ne disparurent pas, mais qu'il se forma encore de nouveaux tubercules pendant le traitement. Malgré l'amélioration observée dans un certain nombre de cas, elle n'a été nulle part « assez éclatante pour être considérée comme une guérison, même tempo- raire ». La diminution des doses, comparativement à celles employées au début par M. Koch et ses collaborateurs, s'explique par les compli- cations et les accidents produits par la tuberculine. On observa dans beaucoup de cas des troubles du côté des reins (albuminurie, héma- turie), du cœur (accélération et faiblesse) et d'autres organes. Dans le lupus, compliqué par d'autres affections tuberculeuses, on a même vu, dans des cas très rares il est vrai, la mort survenir à la suite des injections de tuberculine. Ainsi une jeune fille de 17 ans, atteinte d'un lupus exulcérant de la face, a succombé à la suite d'une seule injection de 0,002 c. c, et à l'autopsie, relatée par M. Jarisch ^ on a 1. Deutsche medic. Wochens., 1891, u» 6, p. 242. 2. Brilish médical Journal, 'M janv. 3. Deutsche mcd. Woch., 1891, a" 1, p. 37. i. Semaine médicale, 1891, n" 8, pp. o4-60. o. Wiener Klinische Wochensch., 1890, n» 50. REVUES ET ANALYSES. 197 trouvé une tuberculose des ganglions et de linteslin, de l'infillration et de l'œdème pulmonaire, ainsi que de l'œdème du cerveau et de la moelle, des ecchymoses de la plèvre et du péricarde, etc. Plus démonstratif encore est un cas observé par M. de Burckhardt ' , concer- nant une fille de 23 ans, atteinte d'un lupus assez étendu du nez, du palais, de la paroi postérieure du pharynx ainsi que de la jambe droite. Après avoir réagi de la façon habituelle à deux injections de 0,005 et 0,008 c. c. , cette malade succomba 22 heures après une troi- sième injection de 0,01 c. c. avec uiie néphrite interstitielle aiguë, sans lésions tuberculeuses autres que le lupus. Après des avertissements de ce genre, les doses de luberculine furent partout de beaucoup diminuées, ce qui supprima les accidents, mais diminua en même temps l'intensité de la réaction et le degré de l'amélioration. Les recherches histologiques sur le lupus traité par la tuberculine démontrèrent avant tout la nroduclion d'une inflammation exsudative très forte, due incontestablement aux injections. Tous les observateurs de ces phénomènes, depuis M. Kromayer -, qui donna la première des- cription microscopique du tissu lupeux pendant la période de la réac- tion, jusqu'à M. Schimmelbusch ', qui a pu étudier très soigneusement 30 cas de tuberculose traités par la tuberculine, sont unanimes à déclarer qu'au lieu de la nécrose, supposée par 31. Koch, le tissu tuberculeux ne subit qu'une inflammation très active, accompagnée d'une infiltration leucocytaire, ainsi que d'une imprégnation par un exsudât séreux et fibrineux. Dans la période aiguë de la réaction, l'épiderme devient vacuoleux à la suite d'une transsudation abondante ; un nombre plus ou moins considérable de leucocytes traverse la couche épidermique, et il arrive souvent que cette dernière éclate pour faire passage à l'exsudat qui se solidifie en donnant les croûtes tant de fois décrites dans le processus du traitement du lupus. Mais, malgré cette inflammation aiguë, les tubercules restent intacts, et si quelques-uns situés plus superficiellement sont éliminés, comme dans les cas de lupus exulcéré, un grand nombre d'autres, logés dans la profondeur du derme, résistent, sans présenter de signes de nécrose ou de dégénérescence. Voici comment M. Schimmelbuscli résume ses recherches histologiques. « Ni au centre, ni à la périphérie des tubercules on n'a pu voir de nécrose en général ou de nécrose de coagulation en particulier, comme l'a supposé M. Koch au sujet de 1. Deutsche medic. IVoch., 1891, n» 3, p. iU. 2. Ibid., 1890, p. 1138. ^.Ibid., 1891, no 6, p. 240. V. aussi Rie), Wiener Ktiri. Wochensclir., 1690, wSi, et .lacobi, Centralbl. f. nUrj. Pathologie, 1890, t. II, n" 2. d98 ANNALES DE L'INSTJTUÏ PASTEUR. l'aclion de son remède. Les cellules épilhélioïdes présentèrent leur aspect habituel, leur noyau était pauvre en chromatine comme d'habi- tude; mais le nucléole et les filaments nucléaires furent nettement accusés; par contre on ne fut en état de constater ni un processus karyolytique, comme on en voit au début de la nécrose, ni un mor- cellement du noyau. » L'examen histologique, démontrant la persistance des tubercules malgré le traitement, prouve donc que ce dernier n'a point amené une guérison définitive. Dans le cas de Klingbeil, mentionné ci-dessus, l'examen histologique d'un nodule, extirpé par M. Schimmelbusch, a permis de prédire la rechute, qui fut constatée plus tard à la clini- que de M. Bergmann. Aux cas déjà décrits, nous pourrions en ajouter encore deux autres ])rovenant du service de M. Quinquaud, à Saint-Louis. L'étude des pièces extirpées avant le traitement, dans la période de la réaction et six semaines après le début du traitement (injection de 0,01 c. c. en 4 doses), démontrèrent une infiltration de la peau par des cellules rondes, et la persistance des cellules épithélioïdes et géantes avec leur structure habituelle, sans aucune trace de nécrose ou dégénérescence. Dans un des deux cas (lupus fermé), nous trouvâmes dans les cellules tubercu- leuses, après six semaines de traitement, quelques bacilles à contours nets, fortement colorés, et en général ne se distinguant en rien des bacilles tuberculeux normaux. VI Nous avons insisté plus longuement sur les résultats obtenus pour le lupus, parce que cette affection tuberculeuse se présente comme la plus favorable pour le traitement par la tuberculine, et pour l'étude des phénomènes réactionnels et histologiques. La facilité d'examiner la structure de tubercules extirpés sur le vivant, exclut les objections qui se soulèvent contre les résultats obtenus sur le cadavre pour les organes internes. Nous pouvons, par contre, être beaucoup plus brefs sur ce qui concerne la tuberculose chirurgicale, d'autant plus qu'ici les données sont en général moins précises et concordantes. Comme le dit M. Mikulicz * dans son rapport qui vient de paraître, « il est encore impossible pour le moment de porter un jugement définitif sur la valeur thérapeutique du remède de Koch dans la tuber- culose chirurgicale. » A côté d'une amélioration manifeste qu'on observe dans un grand nombre de cas, dans d'autres l'état stationnaire 1. Deutsche mcd. Wock., 1891, n" 10, p. o73. |{ INVITES ET ANALYSES. |<»c) persiste, ou il survient même une aggravation plus ou moins marquée. Ainsi. M. Esmarcli * a pu constater, d'un côté, un cas de guéiison très prompte des tistules formées après l'extirpation des ganglions cervicaux et plusieurs cas d'amélioration notable, et d'un autre côté il a observé des cas récalcitrants qui ne manifestèrent aucune tendance vers lagué- rison après un traitement forcé par la tuberculine. M. Mikulicz, de son côté, a obtenu la guérisondans un cas de tuber- culose des os et des articulations; dans plusieurs autres il observa une amélioration notable, tandis que dans une troisième catégorie de cas' comprenant la moitié de ses malades (iA sur 28), aucun changement ne put être constaté. Des études microscopiques de cas de tuberculose chirurgicale furent faites par 0. Israël % à qui l'on doit en général les premiers renseignements positifs sur le tableau histologique de l'effet de la tuber- culine. et qui constata, dans le tissu de la paroi d'un abcès périarticu- laire recouvert d'une couche nécrosée, des cellules géantes, des cellules appelées Mastzellen. et un assez grand nombre de leucocytes. Le con- tenu de cet abcès, puisé après 5 semaines de traitement, lorsque la tuberculine ne donna plus de réaction, et inoculé dans la chambre antérieure de l'œil du lapin, provoqua la formation de tuberculose de l'iris. Cette expérience confirme donc l'assertion de M. Koch que son traitement laisse les bacilles tuberculeux à l'état vivant et virulent. Dans une cicatrice cervicale, provenant d'une extirpation antérieure des ganglions et qui réagit à la tuberculine, M. 0. Israël a pu égale- ment constater la présence de cellules géantes d'aspect normal, ainsi qu'une infiltration considérable par des leucocytes. VII Les affections tuberculeuses de la cavité buccale présentent un intérêt tout particnlier dans la question qui nous préoccupe, parce que les phénomènes qui se passent dans les muqueuses sont les plus faciles à étudier. Dans plusieurs cas on a vu les ulcérations tuberculeuses, après avoir présenté une réaction intense à la tuberculine, se guérir promptement; d'autres fois on a vu, au cours du traitement, l'appari- tion de tubercules qui se résorbèrent après des injections répétées. Ainsi, chez un malade de M. 0. Brieger'*, la langue ne présentait avant le traitement qu'une surface irrégulière et mamelonnée, mais 1. Deutsche med. Woch., 1891, n" 4, pp. 167-172. 2. Bcrliner Klin. Wochensch., 1890, pp. 1127 et 1891. ch. 1, p. 8. ;i. Deuischemed. Woch., 1891, no 5, pp. 202-204. 200 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. se tuméfia après la première injection et se couvrit d'ulcères plats. A la suite de trois autres doses de tuberculine, les ulcères se déter- gèrent et guérirent très promptement, laissant des cicatrices. En renouvelant les injections après un intervalle assez long, la réaction ne se produisit point, de sorte que le malade put être considéré comme réellement guéri. Dans tous ses autres cas, M. 0. Brieger ne put obtenir qu'une guérison partielle et des améliorations mani- festes. D'un autre côté on a observé des malades chez lesquels la tuber- culose de la cavité buccale ne se manifesta que pendant le traitement, en accusant une marche progressive. M. A. Frankol ' montra à la Société médicale de Berlin un malade atteint de phtisie pulmonaire d'un degré moyen, chez lequel une affection tuberculeuse de la langue ne se manifesta que 18 jours après la première inoculation. Malgré la continuation du traitement, l'affecliorx de la langue s'aggrava, et il se forma une ulcération profonde, contenant un gr;md nombre de bacilles tuberculeux. A peu piès six semaines après le commencement des injections, il se forma, à une certaine distance de l'ulcère, des tuber- cules miliaires et submiliaires, dont le développement put être suivi de jour en jour. Celle observation prouve de la façon la plus nette que la tuberculose peut continuer son évolution pendant et malgré le trai- tement le plus prolongé. Un cas, étudié par M. Schimmclbusch % confirme cette conclusion à l'aide d'un examen histologique. H s'agit d'un malade atteint d'une tuberculose du palais, chez lequel le traitement prolongé pendant 47 jours, avec une quantité totale de 0,89 c. c. de tuberculine, fut suivi d'une aggravation de l'ulcération. L'étude microscopique d'une portion d'ulcère excisé démontra la présence de tubercules nombreux et intacts, contenant une grande quantité de cellules géantes et de bacilles tuber- culeux, et ne présentant aucun signe de nécrose. YIII Il n'est point possible de donner pour le moment un aperçu tant soit peu complet et exact du nombre infini de recherches qui ont été faites sur le traitement de la tuberculose des voies respiratoires. Mal- gré toutes les divergences d'opinions, et le passage brusque d'un opti- misme trop exalté à une négation trop absolue, on voit qu'à mesure 1. UcrLncr Kliii. H'oc't., 1301, n» 'A p. 79. Un cas analogue a été observé par M. LiUcjn. Ibid.,\6d0, p. 1171. 2. Deutsche med. Woch., 4891, n'>(;. p. ^i.'i. I REVUES ET ANNALYSES. 201 que rexpôrience augmente, on est d'accord pour diminuer de beaucoup les doses injectées, et pour restreindre de plus en plus le nombre de cas indiqués pour le traitement. Sous le premier rapport nous devons citer MM. Gulmann et Ehrlich ' qui font le traitement à l'hôpital Moabitsous la direction de M. Koch, et qui, dans beaucoup de cas, ne commencenllesinjectionsqu'avec 0,0001 c. c. pour atteindre au bout de 10 jours la dose de 0,001 c. c.,avec laquelle on commençait autrefois le traitement de la phtisie pulmonaire. Malgré ces faibles doses, il suffit d"une quantité de 0,0001 à 0,0002 de tuberculine pour provoquer une réaction locale du larynx et quelquefois môme d'autres organes tuberculeux, tels que les ganglions et autres. Au début on appliquait le traitement à tous les tuberculeux poi- trinaires sans grande distinction. A présent on le limite autant que possible. MM. Gulmann et Ehrlich excluent les malades qui manifestent une réaction fébrile prononcée après des doses de 0,0001 ou 0.0002 c. c. La phtisie avancée, l'hémophtisie, le diabète, les affections cardiaques sont autant de contre-indications, M. Lichtheim- refuse même le traite- ment aux malades atteints de phtisie pulmonaire depuis des années, chez lesquels le mal s'est arrêté et qui se sentent assez bien, malgré des lésions prononcées et la présence des bacilles dans leurs crachats. M. Lichtheim invoque comme raison le fait « que l'amélioration qui pourrait être provoquée par le traitement est trop insignifiante vis-à- vis du risque que peuvent courir de semblables malades. — Car il n'y a pas de doute qu'ils risquent que leur état, satisfaisant pour le moment, nes'aggiave d'une façon durable à la suite du traitement ». Des améliorations plus ou moins considérables ont été constatées dans un grand nombre de cas et par la plupart des observateurs. Mais l'assertion de M. Koch^ que tous les malades traités au début de la phtisie guérissent dans une période de 4 à 6 semaines, et que par con- séquent « la phtisie au début est sûrement guérie par le traitement » , ne s'est réalisée que dans une faible mesure. A l'hôpital de Moabit, où le traitement se fait sous la direction de M. Koch lui-même, et où on a un grand choix de malades, on n'a pas encore obtenu de guérison de la phtisie pulmonaire. M. P. Gutmann^ qui a donné un rapport succinct, ne parle que d'améliorations plus ou moins notables, même dans les cas du début; sur 51 malades à cette période initiale, 41 ont présenté ces améliorations. Comme cas de guérison véritable, on cite toujours les deux malades mentionnées par M. Koch dans son dernier mémoire, e 1. Deutsche jned. Woch., 1891, no \0, p. 373. 2. Ibid.. 18P1, n« 7, p. 27t). 3. UAd., 1890, n» 46, a, p. 1032. 4. Berlincr Klin. Woch., 1891, n» 3, p. 83. 202 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. citéesaussi par M.VI. Gutmann et Ehriich'. Une d'elles, E. Thiel, âgée de 17 ans, a eu, depuis 1889, 9 fois des hémophtisies avec infiltration des deux sommets et des bacilles dans les crachats. Traitée depuis le 30 septembre avec la tuberculine, tous les symptômes disparurent et la malade reprit son air florissant. Une autre malade, B. Lichtenberg, âgée de 25 ans, poitrinaire depuis deux ans, avec une infiltration du sommet gauche, descendant jusqu'à la troisième côte, fut aussi com- plètement guérie après un traitement commencé le 1" octobre. Ces cas importants n'ont pas été encore décrits avec des détails suffisants pour que l'on porte un jugement définitif sur leur signification. En dehors d'eux, il n'y a que peu de données sur une guérison durable de la phtisie à la suite du traitement par la tuberculine. On a plusieurs fois observé la disparition des bacilles dans les crachats, mais tantôt ils réapparaissaient de nouveau^, tantôt il s'agissait de petits foyers qui évacuèrent des bacilles à la suite des injections et se refermèrent. Tout le monde accepte à présent que, dans la phtisie avancée, la tuberculine est conlre-indiquée, comme pouvantoccasionner une aggra- vation redoutable. Mais, tandis que les champions zélés de la nouvelle méthode affirment que dans les cas de phtisie, au début, il n'y a rien à craindre, d'autres citent des cas où la maladie, quoique peu avancée au début du traitement, s'aggrava brusquement à la suite des injections. Parmi les exemples de ce genre, je n'en mentionnerai que deux. M. Naunyn ^ cite un garçon de 18 ans, bien nourri, mais atteint d'un catarrhe initial du sommet. Après deux injections il se déclara une fièvre de plus en plus intense, et le malade mourut à la suite d'une tuberculose miliaire aiguë toute fraîche, qui fut constatée à l'autopsie. Voici le second exemple. A la fin de novembre 1890 entra à l'hôpital Israélite de Berlin un étudiant de 25 ans, robuste et fort, sans autres signes morbides qu'une faible matité du sommet gauche. Les cra- chats renfermaient de nombreux bacilles. Après neuf injections, pra- tiquées pendant trois semaines, le malade, qui se distinguait par son embonpoint, éprouva de la difficulté à respirer et présenta une accé- lération surprenante du pouls. Dès lors la fièvre s'établit, la maladie prit une marche aiguë, et le malade succomba à la suite d'une perfo- ration delà plèvre et d'une tuberculose généralisée*. Ce cas a été étudié au point de vue de l'anatomie pathologique par M. VirchoAv^ qui constata « une perforation rapide de la .plèvre avec 1. BcrI. Kliv. Woch., 1891. u" 7, p. 180. -1. P. ex. dans les cas de M. Openheim., Berl. Klln. Woch.. 1891, n" ;î p. 5(>. ;•.. Deutsche mal. Woch., 1891, n' 9, p. 3W. 4. Berl. Kliii. Woch., 1891, u° 3, p. 8'A. a. Ibid., 1891, n» 3, p. 82. REVUES ET ANALYSES. 203 formation de pneumothorax par suite de l'applicalion du remède ou au moins aprèè celle-ci». M. Virciiow fit voir en outre un assez grand nombre d'autres cas où, malgré les injections de tubercullne, répétées même un grand nombre de fois, la tuberculose prit une marche aigu»'- et finit par amener la mort. Tout dernièrement ' il autopsia un individu chez lequel une tuberculose submiliaire aigui', répandue sur un grand nombre d'organes, enleva le malade un mois après le commencement du traitement. Le développement des tuber- cules put être suivi dans le larynx durant les derniers jours de la vie du malade. Dans un autre cas% traité pendant plus de deux mois, l'autopsie révéla à côté « d'une affection très restreinte d'un sommet, qu'on peut considérer comme plus ancienne, toute une série d'altérations caséeuses et ulcéreuses fraîches qui, évidemment, ont dû se produire pendant la période des injections ». En dehors de la dissémination des tubercules, M. Virchow'* observa, à la suite des injections, des phénomènes inflammatoires très graves, entre autres une pneumonie ressemblant à la pneumonie catarrhale, et caractérisée par une infiltration trouble des alvéoles, l'aggravation des pleurésies qui accusèrent un caractère hémorragique, et la tendance des ulcérations à s'aggraver et à perforer, comme cela a été plusieurs fois constaté pour les ulcérations tuberculeuses des intestins. En ce qui concerne les propriétés des tubercules soumis au traite- ment, M. Virchow * insiste sur leur résistance et sur le manque de phé- nomènes de nécrose autres que ceux qu'on observe habituellement. Les bacilles mêmes ne subissent point de changements notables, res- tant vivants et virulents. Les tubercules ne se résorbent point et n'ac- cusent aucune tendance à s'indurer et à s'encapsuler plus facilement que sans le traitement. Tout au contraire, il est probable que sous 1 influence des injections, « des masses auparavant encapsulées peuvent être mobilisées, de sorte qu'un foyer qui paraissait inoffensif, devient un danger sérieux pour le malade. » D'après M. Virchow, ce ne sont pas les tubercules eux-mêmes, mais plutôt le tissu environnant qui 1. Berliner Klin. Woch., n» '.), p. -237. ■2. Ibid, n" 8, p. 213. 3. Ibid., n» 2, p. 49-3:2. i- M. Frantzel et plusieurs autres observateurs ont supposé d'abord un chaa- gemeut morphologique et cousidérable des bacilles, occasionné par la tuberciiline. Des recherches ultérieures ont montré que ces changements ne présentent rien de spécifi(|ue, et s'opèrent aussi en dehors de toute action du remède. D'un autre côté, M. Liebmann a avancé que, sous l'influence du traitement, les bacilles tuberculeux pénétrent dans le sang et peuventy être retrouvés facilement. Les recherches de iMM. Ewald, Gutmann et Ehriicb, Hlava, et autres ont réfuté l'assertion de M. Liebmann. 204 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. subit l'action la plus accusée, en s'inflatnmant à la suite des injec- tions. M. Kromayer * poursuit cette idée plus loin, en l'appliquant à une théorie de l'action thérapeutique de la tuberculine. Plus un tubercule est entouré de vaisseaux (comme dans le lupus), plus il est accessible à celte action, qui faciliterait la cicatrisation autour de lui. Voilà pou- quoi les plus jeunes et les plus vieux tubercules sont les moins influen- cés par le remède, les premiers n'étant pas encore entourés de vais- seaux, les autres ayant déjà perdu leur entourage vasculaire. M. Rindtleisch ^ qui a étudié le processus curatif des ulcéra- tions intestinales dans un cas de tuberculose interne, traité pendant deux mois par le remède de M. Koch, attribue l'effet thérapeutique à une action assainissante du liquide, qui empêche les bacilles de nuire 1 aux tissus granuleux, permettant par suite à ce dernier de suivre son évolution normale et de se transformer en tissu conjonctif. Malgré une certaine divergence d'opinion, tous les auteurs qui ont fait une étude histologique sur le sujet, M. Rindfleisch aussi bien que M. Kromayer et tant d'autres observateurs mentionnés déjà dans celte revue, sont unanimes à déclarer que les phénomènes de nécrose ne sont nullement provoqués par la tuberculine d'une façon plus accusée que d'habitude. Tous au contraire, ils affirment la présence de cel- lules tuberculeuses (épithélioïdes et géantes) normales dans les tuber- cules, qui ont été pendant longtemps exposées à l'action du remède. M. Rindfleisch dit que dans les ulcères intestinaux guéris, ainsi que dans des cas de guérison de tuberculose pulmonaire ou péritonéale, les cellules géantes présentent un attribut très constant dans toutes pes néoplasies, dans les florissantes aussi bien que dans les anciennes, et paraissent facilement survivre aux bacilles qu'elles renfermaient au début ^. L'examendesphénomènesqui se passent sous l'influence de la tuber- culine dans l'organisme humain, aussi bien que dans le corps des cobayes, dans la tuberculose de la peau et des muqueuses, aussi bien que dans celle des organes parenchymateux, démontre d'une façon évi- dente que la théorie de l'action nécrosante de la tuberculine ne peut être acceptée. Au lieu d'augmenter la nécrose des tissus tuberculeux, la tuberculine les met dans un état de suractivité qui facilite leur résistance vis-à-vis de l'agent morbide. Il y a lieu de s'étonner que tous les observateurs cités, qui ont établi par une étude soignée les données'que je viens de résumer, ne 1. Dcalschii mel. Woch., 1891, u" 8, p. 303. 2. Ibid., no 6, p. 23(i. ;î. L. c, p. 238. lŒVUES ET ANALYSES. 205 '"j^'- disent pas un seul mot au sujet des phagocytes, dont le rùle est cependant tout ;\ fait frappant dans les phénomènes qui nous intéres- sent. Comme il a été démontré plus haut à propos des cohayes, les bacilles tuberculeux, pendant le phénomène de Koch, ainsi qu'après les injections du remède, restent emprisonnés dans l'intérieur des pha- gocytes, qui présentent tous leurs caractères normaux, et dont l'état % vivant et actif est démontré par la facilité avec laquelle ils englobent ^*i^i, le carmin. Il s'agit donc d'une suractivité des phagocytes, occasionnée par la tuberculine. Cette suractivité se traduit par une leucocylose générale, qui a été constatée par plusieurs observateurs, par des phé- nomènes considérables de chimiotaxie et par la résistance plus grande des cellules tuberculeuses — qui sont toutes des phagocytes — vis-à- vis de l'action nuisible des bacilles tuberculeux. N'étant point capables de détruire ces microbes munis d'une enve- loppe très dure, les phagocytes, sous l'influence du remède, parvien- nent à les gêner dans leur développement et à empêcher leur action destructive. Des phénomènes semblables s'observent également dans les cas de résistance naturelle de certains animaux, des rats par exemple, chez lesquels les bacilles restent vivants pendant un temps très long, mais, englobés dans les phagocytes, sont impuissants à nuire à l'organisme. Nous retrouvons un fait analogue avec les spores charbonneuses qui, pendant des mois, restent englobées dans les phagocytes d'animaux résistants, sans être tuées; mais aussitôt que l'animal sera brusquement placé dans des conditions défavorables, qui empêchent les phagocytes de continuer leur action inhibitoire, les bacilles germeront dans l'intérieur de ces cellules mêmes et envahiront l'organisme entier '. Il est tout naturel que les phago- cytes, incapables de tuer les bacilles tuberculeux qu'ils renferment, puissent devenir un des moyens de propagation de ces microbes dans l'organisme et, dans des conditions où la résistance des cellules serait amoindrie, engendrer une tuberculose disséminée. Il va sans dire que l'action phagocytaire dirigée contre le bacille tuberculeux, si manifeste qu'elle soit, ne peut être considérée comme un phénomène tout à fait indépendant de toutes autres influences. Ainsi il est évident que l'inflammation active autour des phagocytes doit exercer une influence sur leur nutrition, et les stimuler peut-être d'une façon toute spéciale. Mais, malgré tout, on a le droit de supposer que l'organisme traité se défend, non point par une couche de tissu mortifié, qui tiendrait le bacille à distance, mais bien par 1. Les faits sur lesquels est basée celle conclusion au sujet des spores char- bonneuses ont été constatés par M. Trapeznikoff, et vont être publiés dans ces Annales. I 206 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. rintermédiaire des phagocytes vivants, qui gêneraient le microbe. Dans la nature il existe des cas d'une résistance encore plus parfaite. Ainsi les cellules géantes et parfois épithélioïdes des spermophiles (animaux peu sensibles à la tuberculose) parviennent à tuer le bacille tuberculeux, d'ordinaire si tenace, et à le transformer en une masse dégénérée et inerte. Cette action qui a été, à un moindre degré il est vrai, observée aussi chez le lapin et même rarement chez le cobaye, est due sans doute à la production par les phagocytes d'une substance particulière très active qui tue et transforme le bacille '. C'est vers ce but que doit tendre tout remède vraiment radical contre la tuberculose. IX 1" En résumant cet aperçu, nous devons insister d'abord sur l'im- portance de la découverte de l'action d'une affection tuberculeuse préexistante sur une introduction ultérieure du virus, et sur celle d'une substance capable d'entraver la marche de la tuberculose chez les cobayes et d'améliorer la tuberculose humaine. Quoique cette décou- verte, due à M. Koch, n'ait point été faite dans une direction absolument nouvelle, mais bien dans la voie des recherches de l'action vaccinante des produits microbiens, elle n'en servira pas moins à approfondir l'étude du fléau le plus terrible du genre humain, et à faciliter la lutte contre lui. Elle constitue le pas le plus considérable fait encore dans cette voie, et si elle n'a pas encore tenu tout ce qu'elle avait promis, on peut dire en revanche qu'elle promet beaucoup plus qu'elle n'a encore tenu; 2° Le bacille n'est point directement atteint par la tuberculine, puis- qu'il conserve sa virulence, mais il est empêché dans son action nuisible par une suractivité des tissus tuberculeux en général et des phagocytes en particulier; l A. V. mon mémoire sur l'aclion phagocytaire dans la tuberculose dans les Archives de M. Virchow, juillet -1888. L'exemple de la tuberculose nous montre bien que M. Koch a eu tort de se jjrononcer aussi nettement contre le rôle des phagocytes, qu'il l'a fait dans sou discours au Congrès de Berlin, Je 4 août 1890. Il y a du reste un malentendu dans son assertion que, dans l'immunité, ce ne sont point les phagocytes, « mais très probablement les phénomènes chimiques qui jouent le rôle principal ». {Ueber bactcriologische Forschang, 1890, p. 10.) L'action phagocytaire, dans laquelle entrent les phénomènes de digestion intracellulaire, [se compose, entre autres éléments, d'influences de substances chimiques produites dans les phago- cytes. Ces derniers s'approchent des microbes par un effet de leur sensibilité, les englobent par suite de leur propriété amiboïde, et les tuent à l'aide de substances contenues dans leur intérieur. Le dilemme de M. Kucii, — action phagocytaire on action chimique, — ne serait donc point justifié. I IIKVUES ET ANALYSES. 207 3o La valeur diagnostique ilc la lubcicuiine peut rendre des grands services à l'étude de l'évolution et de la propagation de la maladie, à la prophylaxie de la tuberculose humaine et à l'agriculture; 4° La tuberculine, beaucoup plus dangereuse pour l'homme que pour le cobaye, ne peut donner l'immunité au premier. Injectée avec une grande prudence, elle produit des améliorations incontestables dans différentes aiïections tuberculeuses, notamment dans celles de la peau. Comme il n'est plus possible d'assurer qu'une guérison complète puisse se produire en \ à G semaines, il est indispensable de prolonger les observations cliniques; 5° Dans le but d'aboutir à une connaissance plus complète des choses, il est indispensable de continuer des recherches expérimentales variées sur plusieurs espèces animales, il serait donc urgent que M. Koch publie des données plus détaillées sur ses expériences avec les cobayes, ainsi que sur la préparation de la tuberculine. El. Metchnikoff. INSTITUT PASTEUR Personnes traitées mortes de la rage. TerLes Barthélémy, 59 ans, forgeron à Saint Sixte (Lot-et, Garonne). Mordu le l*''' janvier 1801 par Un chien reconnu enragé, d'après les renseignements recueillis et à l'autopsie, par M. Bresque, médecin vétérinaire à Valence-d'Agen. Terles présente sur le bord interne de la !'« et de la 2' phalange du pouce gauche une morsure par éraflure, assez pénétrante, longue de 2 centimètres et demi, ayant bien saigné. II s'est cautérisé lui- même au fer rouge 3 heures après l'accident. Terles a subi le traitement à l'Institut Pasteur du o au 19 janvier. Il tombe malade le l«r février et succombe à la rage le 8 février. (Renseignement donné par M. le D"" deLarroque, àLamagistère, Tarn- et-Garonne.) i 208 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. INSTITUT PASTEUR statistique' du traitement préventif de la rage. — FÉVRIER 1891, IMorsures aux mains Morsures à la tête ( simples et à la figure ( multiples . . . . Cautérisations efficaces — inefficaces Pas de cautérisation.' simples multiples . . . . Cautérisations efficaces — inefficaces Pas de cautérisation Morsures aux mem- ( simples bres et au tronc \ multiples . . . . Cautérisations efficaces . . . — inefficaces ... . . . . Pas de cautérisation Habits déchirés Morsures à nu Morsures multiples en divers points du corps Cautérisations efficaces — inefficaces Pas de cautérisatio7i . . . Habits déchirés Morsures à nu TntaiiY S Français et Algériens iotaux. ^ Etrangers 2\ 9/ 7* 16 8 11 28 29 1>6 1 9 8 15 ±\ f29 3^ 6 30^ 26 56 41 ±4\ 18 70; 15 B 85 Total général 134 3/ 1^' 2f 4^ 6 1/ 8^ 9 11 9 I C 20 i. La colonne A. comprend les personnes mordues par des animaux dont la rage est reconnue expérimentalement; la colonne B celles mordues par des ani- maux reconnus enragés à l'examen vétérinaire; la colonne C les personnes mordues par des animaux suspects de rage. Les animaux mordeurs ont été: chiens, 121 fois; chats, 11 fois; ciieval, 1 fois; chacal 1 fois. Le Gérant : G. Masson. Sceaux. — Imprimerie Charaire et fils. 5"» ANNEE. AVIUL 1891, NO 4 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR ETUDE EXPERIMENTALE DES OSTÉOMYÉLITES A STAPHYLOCOQUES ET A STREPTOCOQUES Par mm. LANNELONGUE et ACHARD. (Avec les planches ni, IV, V, VI.) (Travail du laboratoire d'histologie du Collège de France.) Lorsque les mémorables travaux de M. Pasteur eurent posé les bases d'une science nouvelle, la microbie, l'une de ses pre- mières applications à la pathologie eut pour objet l'étude des phénomènes de la suppuration. La thérapeutique en recueillit les premiers fruits, et l'on sait quel merveilleux succès couronna, dès le début, l'emploi de la méthode antiseptique. A son tour, la pathogénie ne tarda pas à bénéficier aussi largement de la nouvelle doctrine. Dès l'année 1880, M. Pasteur, étudiant le pus d'origines diverses, isola par la culture un microbe que ren- fermait un foyer d'ostéomyélite provenant du service de l'un de nous. A la suite de ces recherches, les nombreux travaux qui furent faits, de diirérenls côtés, sur l'origine et la nature de l'os- téomyélite, confirmèrenl, en le précisant, le rôle pathogène du microbe déterminé par M. Pasteur. Mais, dans ces derniers temps, la question a évolué. 11 n'y a plus une ostéomyélite aiguë, mais bien des ostéomyélites aiguës, produites par différents microbes. La même évolution s'est accomplie d'ailleurs dans 14 II 210 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. l'histoire de la plupart des lésions infectieuses qui frappent un même organe et que la classification anatomique des maladies définissait comme autant d'afïections distinctes : elles sont con- sidérées aujourd'hui comme les localisations d'infections variées sur un même organe. C'est à ce point que le présent travail a pour objet d'amener la question de l'ostéomyélite. Il est, à ce titre, la suite naturelle des recherches inaugurées par l'illustre fondateur de la doctrine microbienne. La maladie, généralement désignée aujourd'hui sous le nom d'ostéomyélite aiguë, a depuis longtemps frappé les cliniciens par ses allures d'affection générale. On en trouve la preuve dans les anciens termes de typhus des membres (Chassaignac), fièvre pseudo-rhumatismale (Roser), périostite maligne. C'est qu'en effet, l'ensemble du tableau morbide qui rappelle parfois le rhu- matisme aigu ou la fièvre typhoïde, le caractère de certains accidents, tels que les foyers multiples, les métastases viscérales et toutes les manifestations de la pyohémie, étaient bien propres à faire soupçonner, derrière les lésions localisées au squelette, une influence générale, un de ces états que l'on qualifiait de dyscrasiques et que nous appelons maintenant infectieux. Aussi n'est-il pas étonnant que, dès le début des recherches microbio- logiques qui ont de nos jours transformé l'étiologie générale des maladies, l'on ait songé à démontrer l'origine microbienne de cette affection. Toutefois il convient de présenter les choses sous leur vrai jour en rappelant que les états morbides envisagés par Chassai- gnac, Roser, etc., ne s'adressaient qu'à un groupe d'ostéomyé- lites relativement très peu nombreux, aux formes les plus graves qui seules étaient considérées par eux comme des ostéomyélites, ce qui n'était même pas accepté par la plupart des auteurs. L'un de nous ' a élargi considérablement le cadre de celte affection en montrant, dès l'année 1878, que l'ostéomyélite des jeunes enfants et des adolescents comprenait une longue série de types cliniques, rangés à tort parmi les affections superficielles des os, c'est-à-dire parmi les périostites, ou rattachés inexactement aux ostéites épiphysaires , bien (ju'ils apparussent fréquem- i, Lannelongue, De rostéomyélite aigur pendant la croissance. Paris, 1879 (Mémoire présenté à l'Académie de médecine le 28 mars 1878). ETUDE DES OSTÉOMYÉLITES. 211 ment sur des os dépourvus d'épiphyses. Ces idées avec les con- séquences qu'elles entraînaient et qui ont eu pour résultat de modilior le traitement de ces maladies, ont été généralement acceptées depuis. Les ]»remières recherches microbiologiques furent consacrées seulement à constater au microscope la présence de bactéries dans les tissus lésés. Klebs ', en 1873, y décrivit un tnicrospoiwi sept i eu m ; Uecklinghausen % dans un cas de Liicke, observa des microcoques dans les foyers osseux et viscéraux; Eberth' en vit également dans le sang et le périoste. Neureutter et Salomon signalèrent l'existence de vibrions dans les tissus malades. Max Schiiller"' décrivit et hgura des microbes dans une articulation dont il avait fait l'examen histologique et qui confinait à un foyer d'ostéomyélite infectieuse. En France, M. Nepveu '^ avait aussi observé des microbes dans le pus d'ostéo- myélites provenant du service de M. Verneuil. Bientôt on ne se borna pas seulement à constater in situ la présence de microorganismes dans les tissus malades : on chercha à les isoler par la culture. Dès 1880, comme nous le rappelions tout à Theure, M. Pasteur" obtint avec le pus d'une ostéomyélite, des cultures d'un microbe troublant rapidement le bouillon et tout à fait semblable à celui qu'il venait de dé" couvrir dans le furoncle. Quelque temps après, les procédés de culture surmilieuxsolides vinrent faciliter l'élude decesmicroor- ganismes; ils sont aujourd'hui bien connus: ce sont les staphylo- coques pyogènes et notamment le stapliijlococcus pt/oyenes aureus. Grâce à la méthode des cultures, la présence de ces microbes a pu • 1. Klebs, Arcft. f.experim. Pathol. luidPharmacol., 1873, Bd.I, p. 31 ; — et : BsUrdije zur pathol. Anat. der Schusswunden, p. 120. 2. Ll'ecke, Die pritiiiu-e iufecliuse Knochenmark und Knocheuliuiileulzuuduug : Deutsche Zeilschr.f. Cliir., 1874., Bd. IV, p. 218. 3. Ebehth, Zur Keontniss der Mycosen : Virchow's Archiv f. palliol. Anat. uni Plujsiol., l87o, Bd. LXV, p. 3il. i. Th. Neureutter et Salomox, Œsterr. Jahrb. f. Pdd., 1876, Bd. VJI, p. 23. o. M.\x ScHULLER, Zur Renutniss der iMikrokokkeu bei acuter iafectiôser Osteo- myelitis; Mikrokokkenlierde im Gelenkknorpel : Cf.nlralbl. f. Cliir., 1881, no'42. 6. G. TiiELLiEH, De l'ostéomyélite spontanée considérée dans son éliologie et sa pathogénie : thèse de Paris. 1883. 7. L. Pasteur, De l'extension de la théorie des germes à l'éliologié de quelques maladies communes : Bull, de l'Acad. de médecine, i mai 1880, p. 433. 212 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. être établie dans nombre de cas d'ostéomyélite, par Rosenbach ', Socin et Garré ', etc. Enfin les recherches expérimentales vinrent à leur tour com- pléter la démonstration du rôle pathogène qui appartient aux staphylocoques dans la production de l'ostéomyélite aiguë. Déjà Rosenbach % Kœstlin *, en inoculant du pus dans les veines et en produisant un traumatisme des os, avaient obtenu la suppu- ration osseuse. Par un procédé analogue, c'est-à-dire en fractu- rant des os, mais en injectant dans les veines des animaux des cultures pures du staphylocoque orangé, au lieu de pus, plusieurs expérimentateurs, Becker % Rosenbach % Gangolphe \ obser- vèrent au niveau des foyers de fracture les lésions de l'ostéo- myélite suppurative. F. Krause « obtint même dans un cas, sans traumatisme, un abcès de la moelle osseuse au niveau du col fémoral. Mais c'est surtout M. Rodet qui se rapprocha le plus des conditions réalisées dans la pathologie humaine, en produi- sant les lésions de l'ostéomyélite par l'injection intra-veineuse des staphylocoques pyogènes, sans traumatisme osseux, chez des animaux en voie de croissance ^ Ces recherches ont été reprises récemment par M. Golzi "* qui a consacré à l'étude des lésions ainsi obtenues un important travail; au cours de ses nombreuses expériences, cet auteur a reproduit, non seulement dans ses traits généraux, mais encore dans tous ses détails, la maladie telle qu'elle se présente chez l'homme. Mais dans ces derniers temps, la question de l'ostéomyélite M 1. J. RosENBA(;n, Mikroorganismen bei dem Wundinfectionskrankheiten des Menschen, Wiesbaden, 188i. 2. Socin, Pathogéiiie de la suppuration ; Co)igrés français de cliirurgie, 7 avril 1885, p. 103. 3. J. Rosenbach, Beitriige zur Kenntniss der Osteomyelitis : Deutsche Zeilschr. f. Chir.. 1878, Bd. X, p. 3H9. 4. KoESTLiN, Expi^rimenteiles ûber die akute iafectioses Osteomyelitis ; Inaug- Dissert., Halle, 1880. {Cenlralbl f. Chir.. 1880, p. 32-2.) 5. Deutsche niedicin. Wochoischrift, 188S, p. 663. 6. Mikroorganismen, etc. 7 M. GANiiohi'HE. Soc. des sciences médic. de Lyon, octobre 1884 ; Lyon médical, 2 novembre 1884, p. 283. 8. F. Khause, Ueber einen bei der acuti^n infecliOseu Osteomyelitis des Menschen vorkommeaden Mikrokokkus : Fortschrille der Medicin, 1884, Bdll, p. 221 et 261. 9. A.-J. Rodet, De la nature de l'ostéomyélite infectieuse : lievuc de chirurgie, 1885, p. 273 et 636. — M. Jaboulay, Le microbe de l'oslcomyélite aigur : Thèse de Lyon, 1883. 10. Fk. Coi-zi, Sulla eliologia délia osteonaielite acula: Lo Sperimentale, novembre, décembre 1(589. t ÉTUDE DES OSTÉOMYÉLITES. 213 ainiië infectieuse s'est élargie. On a reconnu que les staphylo- coques pyogèiies ne sont pas seuls à posséder le pouvoir de pro- duire cette lésion. On sait que les streptocoques peuvent aussi lui donner naissance, et nous avons nous-mêmes apporté des matériaux à l'étude clinique et expérimentale de cette nouvelle variété '. De plus, d'autres microbes pyogènes ont encore été rencontrés dans des foyers d'ostéomyélite aiguë. Nous avons pour notre part observé deux exemples de pareilles lésions dues au pneumocoque -. Divers auteurs ont fait des constatations ana- logues pour ie bacille typhique. Il est vrai que, jusqu'à ce jour, la reproduction expérimentale des altérations osseuses n'a pu être faite avec ces deux derniers organismes, dans les mêmes conditions qu'avec les précédents ; toutefois leurs propriétés pyogènes sont assez bien établies pour qu'on ne puisse guère leur refuser le pouvoir de produire également l'ostéomyélite dans l'espèce humaine. En présence de cette pluralité des espèces microbiennes capables d'engendrer le processus de l'ostéomyélite aiguë, la comparaison s'impose entre les lésions qui reviennent àchacuned'elles.Aussi croyons-nous devoir exposer les recherches que nous avons poursuivies avec les streptocoques, et, pour rendre le rapprochement plus facile, nous ferons précéder cette étude d'une description sommaire des lésions expérimentales que nous avons produites avec les staphylocoques. Sur ce pre- mier point d'ailleurs la tâche nous sera aisée, nos résultats no faisant que s'ajouter à ceux des nombreux auteurs qui ont expé- rimenté ces microbes. Lésions produites par les staphylocoques pyogènes A. Staphylococcus pyogènes aureus. Nos expériences ont porté sur des lapins envoie de croissance. Elles ont consisté dans l'injection de bouillon de culture dans 1. Lann'ei.onuie et AcHARn, Sur les microbos de l'ostéomyélite aiguë, dite infec- tieuse : C. l\. de L'Acad. des sciences, 10 mars 1890; Bulletin médical, l!2 mars 1890, p. '239; — et : Des osléomyéliles à streptocoques : C. R. de la Société de biologie, 24 mai 18')0, p. 298; Bullelin médical, 28 mai 1890, p. 492. 2. Lannel'jngue et Achard, Un cas d'ostéomyélite à pneumocoques : Bulletin médical, 24 août 1890, p. 789. — Depuis la publication de ce premier fait nous en avons observé un second dans des conditions'loiit à fait semblables. I 214 ATS NA LES DE L'INSTITUT PASTEUR. les veines de Toreille. Quelques gouttes suffisaient en général pour produire des désordres très marqués et le plus souvent mortels. D'ailleurs nous avons fait varier les conditions relatives à l'âge et au poids des animaux, à l'ancienneté des cultures, aux doses injectées. Ce qui importe surtout pour l'étude des lésions, c'est la durée de la survie. Dans les premières heures qui suivent l'injection, l'on ne trouve à l'œil nu aucune altération. C'est ce qui eut lieu chez trois lapins ; l'un d'eux avait survécu seulement quelques heures à l'inoculation, un autre 19 heures, le dernier 28 heures. Dans un cas, déjà après 20 heures, il existait dans les reins des infarctus rouges et, sur un condyle fémoral, une petite ecchy- mose. Après 36 heures, nous avons pu constater la formation de foyers purulents : il y avait dans les reins des infarctus avec de })etits abcès et, dans les membres, quelques petits abcès sous- périostiques et intra-osseux. Au bout de 42, 43, 48 heures, les lésions des os et des viscères devenaient plus nettes et, au delà de ce temps, nous avons obtenu des lésions généralisées, avec toute la série des altérations du squelette qui caractérisent l'ostéomyélite aigui'. Mais dans quelques cas, bien que la mort ne fût pas survenue d'une façon rapide, les lésions osseuses ont été des plus minimes ou même tout à fait nulles. Chez un jeune lapin, mort 12 jours après l'injection, on ne constatait dans la moelle osseuse qu'un aspect pointillé, dû à de petites taches blanchâtres, tranchant sur le fond rouge ; mais il y avait des abcès dans le foie et surtout dans les reins. Un lapin adulte, infecté par de petites doses répétées de bouillon virulent, ne présentait aucune lésion des os; mais il avait une endocardite et de nombreux abcès rénaux. Enfin chez un jeune lapin, ayant résisté à une inoculation et sacrifié un mois après pour une autre expérience, nous avons trouvé, comme trace de l'injection, des cicatrices rénales, blan- châtres, déprimées, seul vestige de petits infarctus. Ces faits montrent que les lésions rénales peuvent exister à l'exclusion de toute autre, qu'elles sont les plus constantes dans rinfection que produisent les staphylocoques par la voie san- guine, enfin qu'elles sont en général précoces dans leur appari- tion. On lés trouve d'ailleurs signalées avec fréquence parles divers expérimentateurs. Colzi les mentionne souvent dans ses ÉTUDE DES OSTÉOMYÉLITES. 215 nombreuses expériences; Kranse et surtout llibbert ' avaient insisté déjà sur leur importance. Les abcès rénaux se présentent souvent comme de petites taches, de couleur blanc jaunâtre, àla surface de l'organe. Sur la coupe, ce sont de petits foyers miliaires, siégeant soit dans la substance corticale, soit dans la substance médullaire. Mais ils peuvent aussi acquérir un grand volume et donner lieu à de grosses bosselures qui déforment la surface des reins. Quelque- fois on trouve de petits abcès conglomérés, formant une sorte de bouquet de petits grains purulents. Dans un cas, il s'était développé, consécutivement à des abcès superficiels, une périné- phrite suppurée, sous la forme d'un exsudât fibrino-purulent qui infiltrait le capsule d'enveloppe. Avant la formation du pus, on observe dans les reins des infarctus qui se présentent à la surface comme de simples taches d'un rouge sombre. Sur une coupe longitudinale, on reconnaît qu'ils oflrent la disposition classique en pyramides. A un stade plus avancé, leur partie centrale prend une couleurpâle, grisâtre, tandis que le bord, légèrement sinueux, garde une.couleur rouge. Enfin de petits foyers de suppuration se développent dans le territoire de l'infarctus et ils donnent lieu, par leur confluence, h des abcès plus volumineux. Outre les abcès plus ou moins arrondis, on voit fréquemment sur les coupes longitudinales des reins, des stries ou traînées purulentes qui suivent la direction rayonnée des tubes droits et convergent vers la papille. L'examen histologique, au niveau des foyers rénaux, montre des microbes, en amas parfois considérables, dans les vaisseaux de la zone médullaire. Ce sont des amas semblables, disposés entraînées longitudinales, qui donnent lieu aux stries purulentes que nous venons de mentionner. Dans toute la zone mortifiée, il existe en général des microbes disséminés, mais peu nombreux, ne formant que de petits amas dans l'intervalle des tubes, plus rarement dans la cavité même des tubes, dont les cellules sont tuméfiées, en partie desquamées, granuleuses, et presque insen- sibles aux réatifs colorants. L'envahissement des tubes par les microbes a pour conséquence le passage des parasites dans 1. RiBBEfiT, Dio Scliiclcsale der Gsteoniyelitis-Coccen iin Organismus : Deutsche Tnedicin. Wochensch., 16 octobre 1884, p. 682. 216 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. l'urine, maintes fois signalé par les auteurs, et que nous avons pu constater à notre tour. Linfarctus est limité par une zone dans laquelle les interstices des tubes sont bourrés de leucocytes. Enfin, autour de cette zone d'infiltration leucocytique, le tissu rénal présente une vive congestion. Ou peut voir dansle territoire de l'infarctus des hémorragies interstitielles et des abcès plus ou moins volumineux, contenant de nombreux microbes. Toutefois, lorsque les lésions sont déjà un pou anciennes, il est fréquent de trouver des foyers assez considérables, remplis de cellulesembryonnaires,et dans lesquels les microbes ne se rencontrent qu'en très petite quantité. Il arrive aussi, dans les grands infarctus, que les tubes se dépouil- lent complètement de leur épithélium, de sorte qu'on ne trouve plus, dans la zone médullaire, que la charpente conjonctive épais- sie, formant seule la paroi des tubes dont la lumière est incomplè- tement remplie par des amas granuleux ou hyalins. Les artères présentent parfois des lésions d'endartérite végétante. Les autres organes sont atteints de lésions offrant le même type d'infarctus suppuré, mais dans des proportions bien diverses. Les poumons sont rarement le siège d'abcès métastatiques. Le cœur est au contraire fréquemment atteint. Ses lésions consistentende petits points miliaires. d'un blanc jauncître, situés à la surface externe, plus rarement à la surface interne ou môme en plein myocarde. Dans un cas nous avons vu un abcès acquérir le volume d'une lentille. A l'examen histologique on observe un foyer de nécrose, entouré d'une couronne d'infiltration leuco- cytique. Les faisceaux musculaires nécrosés ne se colorent pas par les réactifs, et au centre du foyer se trouve un amas de mi- crobes en forme de zooglée. On rencontre aussi de petits amas de microbes disséminés dans le myocarde. La rate est ordinairement indemne d'abcès. Le foie présente, dans quelques cas, des foyers de suppuration qui pourraient en imposer à l'œil nu pour les productions parasi- taires qu'on y rencontre avec tant de fréquence chez le lapin. Aussi l'examen histologique et les cultures peuvent-ils être nécessaires pour établir leur nature. Nous n'avons point observé que les lésions produites par les coccidies, qui abondaient chez I 1! ÉTUDE DES OSTÉOMYÉLITES. 217 certains do nos animaux, fussent un point d'appel pour le développement des abcès. Un détail qui mérite d'être relevé, c'est qu'on ne trouve pas de dégénérescence graisseuse dans le foie ni dans les reins, qu'il s'a.o-isse d'infection rapidement mortelle, ou bien d'infection à marche plus lente, entraînant la mort après des suppurations multiples. Nous avons pu vérifier ce fait sur des fragments d'or- ganes traités par l'acide osmique. C'est seulement au niveau des infarctus rénaux que nous avons trouvé des traces de matières grasses. Mais dans le reste du rein, l'épithélium était absolument indemne de granulations graisseuses, et dans le foie on trouvait seulement, disséminées dans certaines cellules, quelques granu- lationsexlrèmement fines que l'acide osmique avait colorées en noir. Au contraire, dans l'espèce humaine, il est habituel de rencontrer, chez les sujets ayant succombé aux accidents de l'ostéomyélite, une dégénérescence graisseuse souvent très pro- noncée dans ces organes. Les localisations morbides sur le squelette se montrent sous trois formes : abcès sous-périostiques, abcès et infiltrations intra-médullaires, suppurations articulaires. Les abcès sous-périostiques ont certains sièges de prédi- lection. La surface du tibia en porte fréquemment, soit sur le corps de l'os, soit vers l'extrémité inférieure de la diaphyse. Sur l'humérus, ils se trouvent souvent en divers points de l'ex- trémité supérieure. Le fémur en présente plus rarement, soit au niveau des condyles, soit vers le col. Leur volume est variable. A la surface du tibia (pi. III, fig. 6 et 9) ils sont fréquemment multiples et de dimensions miliaires. Parfois ils sont accompa- gnés de petits points ecchymotiques qui semblent représenter le premier stade du processus; ces deux lésions peuvent, en effet, se superposer et l'on voitalors un petit abcès entouré d'une étroite collerette hémorragique, comme si la suppuration s'était déve- loppée au centre de la tache ecchymolique. Ces abcès sous-périostiques forment de petites élevures jau- nâtres, ressemblant à des grains et contenant une goutte de pus épais qu'on peut faire sortir par piqûre ou tout au moins détacher avec la pointe d'un scalpel. Lorsqu'on a ainsi enlevé ce pus, il reste soit une surface rugueuse, soit une petite dépression cupu- liforme creusée dans l'os; celle-ci peut conduire jusque dans le 218 ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR. canal médullaire et il n'est pas rare de constater la communi- cation d'un foyer sous-périoslique avec un foyer profond. Lorsqu'ils ont une certaine étendue, les abcès sous-périos- tiqut's peuvent donner lieu à la formation d'un séquestre super- ficiel (pi. IH, li^-. llj- Dans les cas un peu anciens, on constate, au pourtour de la dépression correspondant à l'abcès, un épaississement du tissu osseux formant un rebord légèrement saillant et qui représente l'indice d'un processus réparateur. Les abcès intra-médullaires, visibles seulement après qu'on a fendu les os avec un couteau, s'observent de préférence, mais non exclusivement, il s'en faut, dans les régions juxta-épiphy- sairesde la diapbyse des os longs, surtout à la partie inférieure du fémur et à la partie supérieure de l'bumérus (pi. III, fig. 3). Dans les cas anciens, ils forment de petits foyers bien cir- conscrits et comme encapsulés. Mais le plus souvent ils consis- tent seulement en une goutte de pus crémeux, située en pleine moelle et tranchant nettement par sa couleur jaunâtre sur le fond rouge lie de vin du tissu médullaire. D'autres fois, le pus n'est pas collecté et l'on trouve une infiltration diffuse de la moelle dans une étendue plus ou moins grande de la surface de section, (^elte inlillration purulente offre un aspect pointillé, blanc jaunâtre marbré de rouge. T.inlùL la suppuration sièg-e dans la moelle qui remplit la cavité du canal médullaire, vers une extrémité de ce canal, tantôt elle se développe dans la zone de tissu spongieux qui termine la diapbyse et qui confine au cai'lilage de conjugaison. On voit alors les Irabécules de ce tissu spongieux prendre une couleur jaunâtre, devenir plus friables et s'infiltrer de pus. Quelquefois mèmt'. il se forme un petit séquestre isolé, baignant dans le foyer purulent. Enfin la suppuration peut s'étendre jusqu'au f onlacl immédiat du cartilage de conjugaison, former en ce point une véritable nappe purulente et amener ainsi le décollement épipliysaire (j.!. Ill, fig. IQ). Cet accident peut aussi résulter du «iéveloppement d'un abcès sous-périostique, formé à l'union de la diapbyse et del'épiphyse et qui, en s'étendant progressive- ment, s'enfonce comme un coin, le long du cartilage, dans la profondeur de l'os. La supi.uralion de la moelle osseuse ne s'observe pas exclu- ÉTUDE DES OSTEOMYELITES. 219 sivement dans la diaphyse des os longs. On peut encore la cons- tater dans les épiphyses, mais d'une façon beaucoup plus rare, et en cela la pathologie expérimentale se trouve parfaitement d'accord avec la pathologie humaine. Il n'est pas exceptionnel qu'un foyer, né dans la portion juxta-épiphysaire de la diaphyse, arrive à détruire le caflilage de. conjugaison et envahisse l'épi- physe. Mais on peut aussi rencontrer des foyers de suppuration développés primitivement dans l'épiphyse elle-même. Ajoutons que, dans la plupart des os, alors même qu'il ne s'y trouve point de lésions suppuratives, la moelle présente une congestion vive et une couleur lie de vin. Cette congestion veineuse existe souvent encore, d'une façon générale, dans presque tous les membres. Au niveau des lésions osseuses, l'examen histologique fait voir de nombreux microbes, tantôt agglomérés en amas compacts, tantôt disséminés par petits groupes ou répandus comme une fine poussière dans le tissu médullaire, et parfois à une grande distance des foyers principaux. Les amas microbiens s'observent, soit dans le canal médullaire, soit dans les aréoles du tissu spongieux. On les trouve encore dans la substance compacte, au voisinage des abcès intra-osseux et sous-périos- tiques ; ils s'y rencontrent parfois en telle abondance qu'ils oblitèrent complètement les canaux de Havers. Enfin les petits abcès miliaires que présente le périoste renferment une accu- mulation de microbes à la partie profonde de la membrane, et les portions voisines du tissu compact eu contiennent aussi une grande quantité (pi. III, fig. 1, et pi. lY, fig. 1 et 2). La disposi- tion des foyers microbiens dans la moelle osseuse rappelle exac- tement ce que l'on peut voir sur les fragments extraits chez les malades par la trépanation. Les arthrites purulentes ne sont pas rares dans l'infection parle staphylococcus aureus. Souvent elles sont liées à l'exis- tence de lésions des os voisins et représentent en quelque sorte l'abcès sous-périostique d'un foyer siégeant à l'extrémité articu- laire de l'os. Mais, dans certains cas, elles en sont tout à fait indépendantes ; ce sont de véritables localisations métastatiques, comparables aux épanchements purulents des grandes séreuses (plèvre, péricarde;, qui s'observent exceptionnellement dans l'infection expérimentale chez le lapin, mais qui sont loin d'être 2i>0 ANNALES DE L'LNSÏITUT PASTEUR, aussi rares dans la pathologie humaine. Ces arthrites frappent non seulement les grandes jointures (épaule, coude, genou, hant-lie), mais aussi les petites articulations du carpe et du tarse. Plusieurs fois, sans qu'il y eût d'arthrite véritable, nous avons trouvé sur la synoviale articulaire une vive injection et même des taches ecchymotiques. Ajoutons, pour compléter la série des lésions qui siègent dans les membres, qu'on observe de la suppuration des syno- viales tendineuses, et des abcès, parfois très volumineux, dans le tissu coiijonctif inter-musculaire. Les muscles peuvent être atteints à des degrés très divers. Quelquefois ils présentent simplement de petites taches congestives, comme des têtes d'épingle, et de petits abcès punctiformes, de couleur jaunâtre. Mais les abcès y peuvent atteindre de grandes dimensions, les muscles peuvent être envahis par des abcès venus des parties voisines ; ils sont alors décollés par la suppuration ; souvent aussi, ils sont seulement infiltrés de pus dans toute leur masse et présentent un aspect jaunâtre, lardacé. On reconnaît au microscope que cette infiltration correspond à des amas de microbes, formant des traînées dans les interstices des fibres, et â une abondante migration de globules blancs. Quant aux fais- ceaux primitifs, ils peuvent persister avec leurs caractères nor- maux au milieu des microbes et des leucocytes ; mais d'autres fois il sont gonflés, régulièrement cylindriques, homogènes et vivement colorables par le carmin ; souvent encore on y observe la multiplication des noyaux. Quant aux microbes, ils ne sont pas toujours abondants aux points où les éléments embryonnaires sont le plus nombreux, et même ils peuvent faire entièrement défaut dans des portions de muscles qui sont complètement infiltrées de leucocytes. C'est là d'ailleurs une remarque générale qui s'applique aux lésions de tous les organes : les tissus qui présentent au plus haut degré la migration des leucocytes et la prolifération cellulaire ne sont pas ceux qui renferment le plus de microbes. B. Stapliijldcoccus pfjogene.s al bus. Le filajiliijlococcus pfio(jmes albus a été souvent rencontré, associé as'ecliistaphi/loroirusaureus, dans le pus d'ostéomyélites. V ■^ ÉTUDE DES OSTÉOMYÉLITES. 221 Rosenbach, Garré, Fowler ', Kraske, Golzi, Per[ik% mentionnent cette coïncidence ; nous en avons nous-mêmes ol>servé un exemple. Mais ce microbe peut aussi exister seul dans les foyers osseux,